UPLC法測定不同加工方式鹿茸中的生物胺成分

王燕華，孫印石*，王玉方，陳 寶，霍曉慧，劉 暢，張 磊

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

鹿茸是鹿科動(dòng)物梅花鹿CervusnipportTemminck或馬鹿CervuselaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角,前者習(xí)稱“花鹿茸”，后者習(xí)稱“馬鹿茸”。夏、秋二季鋸取鹿茸，經(jīng)加工后，陰干或烘干[1-2]即得。鹿茸的加工可分為排血加工和帶血加工，按照干燥方式又可分為沸水煮炸和冷凍干燥。根據(jù)組織結(jié)構(gòu)特征，整枝鹿茸由尖部至基部可分為蠟片、粉片、紗片、骨片4個(gè)部位。生物胺是一類具有生物活性、含氨基的低分子量化合物，主要由微生物氨基酸脫羧酶作用于氨基酸脫羧或經(jīng)胺化醛和酮的轉(zhuǎn)氨基作用而生成[3-4]。生物胺廣泛存在于魚及其制品、發(fā)酵食品及飲料中[4-6]，是合成激素、堿基、核苷酸、蛋白質(zhì)等的前體物質(zhì)，適量攝入生物胺可促進(jìn)生長、加速代謝、增強(qiáng)免疫力、清除自由基等，但攝入過量則會(huì)引起頭疼、腹部痙攣、嘔吐等不良生理反應(yīng)[5-11]。富含蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品、肉類及其制品中生物胺的含量與其品質(zhì)密切相關(guān)，對(duì)產(chǎn)品的感官特性也有一定影響[6]，生物胺有望成為評(píng)價(jià)此類食品新鮮程度的一個(gè)指標(biāo)[11-13]。李可強(qiáng)等[14]對(duì)不同加工方式的馬鹿茸中腐胺的含量進(jìn)行了對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)煮炸茸中腐胺的含量高于凍干茸，排血加工的腐胺含量高于帶血加工，蠟片中含量最高，但未見有關(guān)不同加工方式或不同部位花鹿茸中生物胺含量差異的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)同時(shí)檢測鹿茸中的10種生物胺組分，并對(duì)不同加工方式及不同部位的花鹿茸中生物胺的含量進(jìn)行對(duì)比分析，旨在為鹿茸的加工及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；EX125DZH電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；MS204S電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q Advantage A10超純水器(美國Millipore公司)；XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；JP-100ST超聲清洗機(jī)(廣州市潔盟超聲波清洗設(shè)備有限公司)；QYC-2102C恒溫培養(yǎng)搖床(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

鹽酸、無水碳酸鈉、丙酮、氨水(分析純，北京化工廠)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；丹磺酰氯(上海源葉生物科技有限公司)；高氯酸(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)。

對(duì)照品購自上海源葉生物科技有限公司。色胺(批號(hào)即LOT為:KM0522YB14)，2-苯乙胺(LOT:T28M6C1)，腐胺(LOT:L05D6S7162)，尸胺二鹽酸鹽(LOT:P1069349)，組胺(LOT:Y22F8J29786)，5-羥色胺鹽酸鹽(LOT:BO1022DA14)，酪胺鹽酸(LOT:XJ0704XA14)，亞精胺(LOT:A29M7L12090)，多巴胺鹽酸鹽(LOT:S05J6G2)，精胺(LOT:B10D7L26660)。

對(duì)照品溶液的配制:準(zhǔn)確稱取色胺、腐胺、尸胺二鹽酸鹽、組胺、5-羥色胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸、亞精胺、多巴胺鹽酸鹽、精胺各5 mg，移取2-苯乙胺100 μL，置于10 mL容量瓶中，以0.1 mol/L鹽酸溶解并定容，配制成單標(biāo)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確量取各單標(biāo)溶液2 mL于25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)液母液。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

鮮鹿茸購自吉林省雙陽區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所李春義研究員鑒定，為梅花鹿(CervusnipportTemminck)的茸角(二杠)。參考文獻(xiàn)方法[15]，隨機(jī)取3副鮮鹿茸進(jìn)行煮炸與凍干的對(duì)比加工，加工完成的鹿茸分別稱為“煮炸茸”(CCP with boiling process，Boil)和“凍干茸”(CCP with freeze-drying technology，F(xiàn)reeze)；取3副鮮鹿茸進(jìn)行排血與帶血的對(duì)比加工，加工完成的鹿茸分別稱為“排血茸”(blood-drained CCP，Drain)和“帶血茸”(blood-filled CCP，F(xiàn)ill)。每種加工方式的鹿茸按蠟片(Wax slice)、粉片(Powder slice)、紗片(Gauze slice)、骨片(Bone slice)、整枝(Entire)分為5個(gè)樣品。

1.3 樣品處理

1.3.1鹿茸樣品生物胺試液的制備參考文獻(xiàn)方法[16]，準(zhǔn)確稱取鹿茸樣品粉末0.20 g，置于4 mL離心管中，加入0.4 mol/L高氯酸2.0 mL，靜置過夜，超聲10 min，10 000 r/min離心10 min。

1.3.2生物胺的衍生化參考文獻(xiàn)方法[16]，準(zhǔn)確吸取鹿茸生物胺提取液0.5 mL于4 mL離心管中，加0.9 mL飽和碳酸鈉溶液、0.5 mL丹磺酰氯溶液(10 g丹磺酰氯/L丙酮)，渦旋混勻，置于控溫?fù)u床，40 ℃避光振搖1 h。振搖結(jié)束后，加100 μL氨水終止反應(yīng)，用1.0 mL乙腈萃取目標(biāo)物，6 000 r/min離心5 min，上層液過0.22 μm濾膜，上機(jī)備用。

1.4 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC@BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B)。洗脫程序:0～5 min，55%～95% A；5～6 min，95% A；6～7 min，95%～55%A；7～9 min，55%A。柱溫35 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量3 μL，檢測波長217 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相的選擇生物胺屬于有機(jī)堿，部分組分呈現(xiàn)一定的堿性，進(jìn)行色譜分析時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)拖尾。乙酸銨溶液與甲醇、乙腈等常見流動(dòng)相混溶，具有較強(qiáng)的緩沖能力，常被用作改良劑添加到分析不同pH值化合物的流動(dòng)相中，以減少次級(jí)保留，改善峰形，提高積分準(zhǔn)確度。但高濃度乙腈洗脫易導(dǎo)致乙酸銨出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象，造成銨鹽殘留在色譜柱中。進(jìn)一步考察了未添加乙酸銨的乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)的效果，結(jié)果顯示，10種生物胺組分能基線分離，拖尾現(xiàn)象不明顯。原因可能是通過衍生化反應(yīng)，生物胺轉(zhuǎn)化為酰胺類成分，堿性變?nèi)跎踔料?，且反?yīng)副產(chǎn)物及過量的衍生試劑不干擾目標(biāo)物的分離。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇未添加乙酸銨的乙腈-水作為流動(dòng)相。

圖1 生物胺對(duì)照品(A)與鹿茸樣品(B)的色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of biogenic amine standard reference substances(A) and CCP sample(B)1.Try；2.2-Phe；3.Put；4.Cad；5.His；6.5-HT；7.Tyr；8.Spd；9.Dop；10.Spm

2.1.2洗脫程序的確定實(shí)驗(yàn)嘗試采用50%、55%、60%乙腈作為初始洗脫梯度，結(jié)果表明，以50%乙腈作為初始條件時(shí)出峰雜亂，不能將10種生物胺成分分開；55%乙腈初始洗脫時(shí)，10種生物胺組分可基線分離，且無明顯拖尾；60%乙腈作為初始梯度時(shí)，雖然整體保留時(shí)間提前，10種組分全部洗脫出峰，且峰寬均勻一致，但尸胺與組胺的分離效果不佳。因此，最終采用55%乙腈作為初始洗脫梯度。

2.1.3檢測波長的選擇10種生物胺衍生物的最大吸收波長為215.6～218.0 nm，選擇217 nm作為檢測波長，可使10種生物胺組分的峰高達(dá)到最大，易于觀察和分析生物胺對(duì)照品譜圖及鹿茸樣品的色譜圖(見圖1)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1線性范圍與檢出限混合標(biāo)準(zhǔn)母液中10種生物胺的質(zhì)量濃度分別為25.00、38.49、22.24、35.80、23.88、30.16、21.64、16.00、31.28、23.56 mg/L。分別準(zhǔn)確吸取20 mg/L生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液母液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于5 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋定容，按“1.3.2”方法進(jìn)行衍生化并上機(jī)測定。以10種生物胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。10種生物胺具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997 8～0.999 9。將最低濃度的各生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，以3倍噪音響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的濃度作為檢出限，10倍噪音響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的濃度為定量下限(見表1)。

表1 10種生物胺的相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍、檢出限及定量下限Table 1 Correlation coefficients(r)，linear ranges，limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of ten biogenic amines

2.2.2精密度、穩(wěn)定性與重復(fù)性取4 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“1.4”色譜條件上機(jī)測試，各成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.10%～1.2%，說明儀器精密度良好。取排血茸紗片的供試樣品溶液，按“1.4”色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、16 h進(jìn)樣，對(duì)各成分峰面積積分，計(jì)算得RSD為0～1.9%，說明樣品的穩(wěn)定性良好。準(zhǔn)確稱取0.20 g排血茸紗片各6份，按“1.3”方法制備供試樣品溶液，按“1.4”色譜條件上機(jī)測試，對(duì)各成分峰面積積分，得RSD為0～4.2%，說明樣品的重復(fù)性良好。

2.2.3回收率試驗(yàn)向鹿茸樣品中分別添加2、4、8 mg/L 3個(gè)水平的生物胺混合對(duì)照品溶液，每個(gè)水平做5個(gè)平行，按“1.3”方法制備供試品溶液，按“1.4”色譜條件上機(jī)測試，計(jì)算加標(biāo)回收率及RSD(表2)。樣品加標(biāo)回收率為71.6%～101%，RSD為0.70%～11.4%。表2中部分化合物的回收率偏低，可能是由于樣品的制備需經(jīng)衍生化，增加了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的損失概率。

表2 10種生物胺的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Spiked recoveries and RSDs of 10 biogenic amines

2.3 實(shí)際樣品的檢測

準(zhǔn)確稱取鹿茸樣品0.20 g，平行3個(gè)，按“1.3”方法制備供試樣品溶液，按“1.4”色譜條件上機(jī)測試。

2.3.1煮炸茸與凍干茸中生物胺的對(duì)比分析由表3可知，煮炸茸蠟片、粉片、紗片、骨片部位腐胺的含量依次為102.75、119.04、74.49、32.84 mg/kg，均高于凍干茸，且分別為凍干茸相應(yīng)部位的1.66、1.73、1.69、1.53倍。煮炸茸與凍干茸蠟片部位亞精胺含量分別為114.20 mg/kg和107.96 mg/kg，二者差異不顯著(P>0.05)；凍干茸粉片、紗片、骨片部位中亞精胺含量依次為43.05、32.75、25.06 mg/kg，高于煮炸茸的20.77、1.62、2.63 mg/kg，且均差異顯著(P<0.05)。凍干茸蠟片、粉片、紗片、骨片部位精胺的含量依次為96.62、22.41、20.90、15.82 mg/kg，顯著高于煮炸茸，且分別為煮炸茸相應(yīng)部位的1.47、2.26、7.04、3.90倍。煮炸茸蠟片、粉片、紗片、骨片部位的酪胺含量分別為15.18、10.05、7.75、5.70 mg/kg，高于凍干茸相應(yīng)部位，且均差異顯著(P<0.05)。煮炸茸不同部位多巴胺的含量在7.97～11.57 mg/kg之間，凍干茸在8.36～9.57 mg/kg之間。組胺、色胺、2-苯乙胺在煮炸茸與凍干茸中的含量均很少，且在不同部位間的分布規(guī)律不明顯。5-羥色胺與尸胺在凍干茸中未檢出，其中5-羥色胺僅在煮炸茸蠟片和紗片中測出，含量分別為1.36 mg/kg和1.56 mg/kg，尸胺僅在煮炸茸紗片中測出，含量為0.96 mg/kg。

表3 煮炸茸和凍干茸中的生物胺含量(mg/kg)Table 3 Biogenic amine content in CCP with boiling process and freeze-drying technology(mg/kg)

*:content is below the detection limit or the quantitative limit；a-h:the significant difference at the level ofP=0.05；the same number on the same line with the same letter means no significant difference(P>0.05)，otherwise it means that there is a significant difference(P<0.05)

所測10種生物胺總量在煮炸茸與凍干茸不同部位的分布趨勢(shì)一致，即蠟片>粉片>紗片>骨片，煮炸茸與凍干茸蠟片部位的生物胺總量分別為312.33 mg/kg和291.77 mg/kg，二者差異顯著(P<0.05)。煮炸茸粉片部位的生物胺總量為176.88 mg/kg，顯著高于凍干茸的152.85 mg/kg(P<0.05)。兩種加工方式鹿茸紗片部位的生物胺總量分別為105.31 mg/kg和114.49 mg/kg，二者無顯著性差異(P>0.05)。煮炸茸骨片部位的生物胺總量為55.674 mg/kg，低于凍干茸的74.73 mg/kg，差異顯著(P<0.05)。整體上，煮炸茸中生物胺總量低于凍干茸，且差異顯著(P<0.05)，與李可強(qiáng)等[14]的結(jié)論不一致?？赡芘c樣品群體差異性或儲(chǔ)藏環(huán)境有關(guān)，有待進(jìn)一步分析證明。

2.3.2排血茸與帶血茸中生物胺的對(duì)比分析由表4可知，排血茸中檢測到9種生物胺，其中5-羥色胺只在蠟片中檢出，含量為2.08 mg/kg；本實(shí)驗(yàn)所測10種生物胺均在帶血茸中檢出，與排血茸相同，只在蠟片中檢測到5-羥色胺，含量為1.58 mg/kg。尸胺在鹿茸中的含量很低，僅測出帶血茸骨片中含有0.02 mg/kg。腐胺、亞精胺、精胺的含量較高。腐胺在排血茸與帶血茸中的分布均以粉片部位最高，分別達(dá)155.63 mg/kg和147.23 mg/kg，二者差異顯著(P<0.05)；蠟片、紗片、骨片部位的腐胺含量依次減少。排血茸蠟片部位的腐胺為125.24 mg/kg，分別是紗片、骨片部位的1.28和2.28倍。帶血茸蠟片部位的腐胺為118.62 mg/kg，與排血茸蠟片部位差異顯著(P<0.05)；紗片、骨片部位分別含腐胺92.47 mg/kg和51.93 mg/kg。亞精胺在排血茸與帶血茸中的分布呈現(xiàn)蠟片、粉片、骨片、紗片依次減少的趨勢(shì)。兩種加工方式下鹿茸蠟片部位的亞精胺含量分別為122.18 mg/kg和114.61 mg/kg，二者差異顯著(P<0.05)。精胺在不同部位的分布規(guī)律與腐胺一致。排血茸蠟片、粉片、紗片、骨片部位的精胺含量分別為71.44、11.63、2.95、3.12 mg/kg。帶血茸蠟片部位含精胺74.55 mg/kg，高于排血茸，且差異顯著(P<0.05)。精胺在帶血茸粉片、紗片、骨片部位的含量與排血茸無顯著性差異(P>0.05)。酪胺在蠟片、粉片、紗片、骨片部位的含量逐漸減少，排血茸中依次為15.49、11.53、7.74、6.57 mg/kg，帶血茸中分別為14.93、10.23、7.77、6.35 mg/kg；同種加工方式不同部位之間均有顯著性差異(P<0.05)。與酪胺相比，多巴胺在排血茸與帶血茸不同部位的分布相對(duì)均勻。排血茸蠟片、粉片、紗片、骨片中多巴胺的含量分別為10.42、11.52、10.12、9.27 mg/kg，帶血茸中相應(yīng)部位依次為9.40、11.67、9.76、11.61 mg/kg；帶血茸骨片部位的多巴胺含量高于排血茸，差異顯著(P<0.05)。排血茸與帶血茸骨片部位均未檢出組胺，在排血茸和帶血茸蠟片、粉片、紗片中組胺的含量依次為4.12 mg/kg和4.19 mg/kg、2.42 mg/kg和2.05 mg/kg、0.59 mg/kg和0.28 mg/kg，均呈現(xiàn)蠟片、粉片、紗片、骨片依次減少的趨勢(shì)。2-苯乙胺在鹿茸不同部位的分布無明顯規(guī)律，且含量較少。

對(duì)生物胺總量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，排血茸蠟片、粉片、紗片、骨片部位的總量分別為357.07、226.26、125.18、77.74 mg/kg，均高于帶血茸相應(yīng)部位的含量343.42、216.72、125.15、76.16 mg/kg。排血茸的生物胺總量高于帶血茸，二者差異顯著(P<0.05)，與李可強(qiáng)等[14]的結(jié)論一致。兩種加工方式鹿茸的生物胺總量在不同部位的分布均表現(xiàn)為蠟片、粉片、紗片、骨片逐漸減少，不同部位之間差異顯著(P<0.05)。

表4 排血茸和帶血茸中的生物胺含量(mg/kg)Table 4 Biogenic amine content in blood-drained CCP and blood-filled CCP(mg/kg)

*:the content is below the detection limit or the quantitative limit；a-h represent the significant difference at the level ofP=0.05；the same number on the same line with the same letter means no significant difference(P>0.05)，otherwise it means that there is a significant difference(P<0.05)

2.3.3鹿茸中的生物胺組分鹿茸中含有本實(shí)驗(yàn)所測10種生物胺組分，但尸胺和5-羥色胺的含量很低，僅在1×100mg/kg數(shù)量級(jí)甚至更低，凍干茸中未檢出。腐胺含量最高，達(dá)1×102mg/kg，與李可強(qiáng)等[14]的報(bào)道一致。精胺、亞精胺次之，含量在(1～5)×102mg/kg。鹿茸中酪胺、多巴胺的含量在1×101mg/kg左右。色胺、2-苯乙胺、組胺的含量僅在(0～0.5)×101mg/kg。不同加工方式的鹿茸中生物胺總量在129.16～170.20 mg/kg之間，整體表現(xiàn)為凍干茸高于煮炸茸，排血茸高于帶血茸。

2.4 生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)

聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)于2012年聯(lián)合公布了水產(chǎn)品中生物胺的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)議報(bào)告。美國規(guī)定水產(chǎn)品中組胺的含量不得超過50 mg/kg；歐盟規(guī)定食品中組胺的含量不得超過100 mg/kg，酪胺含量不得超過100～800 mg/kg；我國規(guī)定鮐魚中組胺的含量不得超過1 000 mg/kg，其他海產(chǎn)魚類中不超過300 mg/kg。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，鹿茸中的組胺和酪胺均遠(yuǎn)低于限量值。目前尚無鹿茸中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)，原因可能是生物胺更易在發(fā)酵食品中生成，鹿茸中的生物胺含量遠(yuǎn)低于生物胺的危害值，即在安全范圍內(nèi)。

3 結(jié) 論

本文對(duì)不同加工方式花鹿茸中的10種生物胺按不同部位分別進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，鹿茸中的生物胺總量在不同部位具有明顯的分布規(guī)律，即蠟片部位>粉片部位>紗片部位>骨片部位,整體表現(xiàn)為凍干茸高于煮炸茸，排血茸高于帶血茸。研究結(jié)果有望為鹿茸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及鹿茸產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。