液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定中成藥與保健食品中非法添加的9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物

張秋炎，羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，朱志鑫，黃 芳，林曉珊，謝夢婷，吳慶暉，馬葉芬

(廣東省測試分析研究所 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070)

高尿酸血癥是以體內(nèi)嘌呤代謝紊亂、血尿酸增高為主要特征的病癥[1]，可誘發(fā)痛風(fēng)、尿石癥、慢性腎病等疾病[2]，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[3]，并與肥胖、高血壓、高血糖和血脂紊亂等代謝綜合征相關(guān)[4]。高尿酸血癥主要由尿酸生成過多或排泄不足所致，因此，目前臨床上常用的尿酸調(diào)節(jié)類藥物主要有兩大類[5-8]：抑制尿酸生成的別嘌醇、奧昔嘌醇、非布司他、托匹司他等黃嘌呤氧化酶抑制劑，以及促進(jìn)尿酸排泄的丙磺舒、磺吡酮、雷西納德、阿鹵芬酯等藥物。此外，氯沙坦也可以促進(jìn)尿酸排泄而作為尿酸調(diào)節(jié)類藥物使用[9]。

近年來，市場上出現(xiàn)了宣稱可以治療高尿酸血癥或緩解痛風(fēng)癥狀的中成藥和保健食品，而一些不法廠商為牟取暴利向其中非法添加上述尿酸調(diào)節(jié)類西藥成分，以迅速增強(qiáng)療效來吸引目標(biāo)人群。在不知情的情況下長期使用會(huì)引起藥物毒副反應(yīng)，對消費(fèi)者的身體健康造成嚴(yán)重威脅，甚至危及生命，如丙磺舒和磺吡酮等藥物會(huì)引起造血功能障礙[10-11]。因此，建立中成藥和保健食品中尿酸調(diào)節(jié)類藥物的檢測方法，對打擊非法添加行為、保障消費(fèi)者身體健康具有重要意義。

目前，針對中成藥和保健食品中非法添加尿酸調(diào)節(jié)類藥物的檢測方法尚未見報(bào)道。本文通過優(yōu)化樣品前處理手段和色譜-質(zhì)譜條件，首次建立了一次進(jìn)樣可同時(shí)測定中成藥和保健食品中9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，這些藥物包括別嘌醇、奧昔嘌醇、非布司他、托匹司他、丙磺舒、磺吡酮、雷西納德、阿鹵芬酯和氯沙坦，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1。本法樣品處理簡便快速、成本低、靈敏度高、定性可靠、定量準(zhǔn)確，已成功應(yīng)用于日常分析檢測，可為中成藥和保健食品中非法添加尿酸調(diào)節(jié)類藥物的定性篩查及定量分析提供技術(shù)支持，為政府相關(guān)部門提高監(jiān)控水平提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)保障。

圖1 9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of nine uric acid regulation drugs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200 SL Series RRLC/6410B Triple Quard MS快速高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；AS 3120超聲波發(fā)生器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；賽多利斯TP-114電子天平(美國Sartorious公司)；XW-80A快速混勻器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)。甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司)；甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨(LC-MS級(jí),美國Sigma公司)；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

9種標(biāo)準(zhǔn)品：奧昔嘌醇(Oxipurinol，純度97%)、別嘌醇(Allopurinol，純度98%)、雷西納德(Lesinurad，純度98%)和非布司他(Febuxostat，純度98%)均購自加拿大TRC公司；托匹司他(Topiroxostat，純度98.54%)購自美國MCE公司；氯沙坦(Losartan，純度99.9%)和丙磺舒(Probenecid，純度99.5%)購自中國食品藥品檢定研究院；磺吡酮(Sulfinpyrazone，純度99%)和阿鹵芬酯(Arhalofenate，簡稱MBX-102，純度99%)購自美國Sigma公司。

所用的中成藥和保健食品均為客戶委托送檢樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg(精確至0.01 mg)至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度(奧昔嘌醇、托匹司他不能完全溶于甲醇，需加少量二甲亞砜助溶)，混勻得到1 000 mg/L的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置棕色儲(chǔ)液瓶中，于-20 ℃保存。臨用時(shí)，以10%乙腈或空白基質(zhì)提取液將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

固體樣品：膠囊取內(nèi)容物，片劑、丸劑、顆粒劑研磨成粉末后混勻。準(zhǔn)確稱取均勻試樣1.0 g(精確至0.01 g)于10 mL具塞刻度試管中，加入2 mL水，渦旋1 min，加7 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取20 min，取出，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度，混勻，準(zhǔn)確移取1 mL至10 mL具塞刻度試管中，用水稀釋至刻度，混勻，過0.22 μm濾膜后，供測定。

液體樣品：充分搖勻。準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g(精確至0.01 g)于100 mL具塞刻度試管中，用10%乙腈定容至刻度，振搖混勻，過0.22 μm濾膜后，供測定。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1液相色譜條件色譜柱：Agilent Poroshell 120 Bonus-RP(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)；流動(dòng)相：A相為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙酸溶液(含5 mmol/L甲酸銨)，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.50 min，0%B；1.51～8.50 min，0%～50%B；8.50～8.51 min，50%～75%B；8.51～10.00 min，75%～95%B；10.00～11.50 min，95%B；11.50～11.51 min，95%～0%B；11.51～17.00 min，0%B。流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

1.4.2質(zhì)譜條件離子源：ESI；掃描模式：正離子；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；干燥氣(N2)溫度：350 ℃；霧化氣(N2)壓力：276 kPa(40 psi)；干燥氣(N2)流量：9.0 L/min；毛細(xì)管入口端電壓(Capillary)：5 000 V；優(yōu)化后的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的分子式、保留時(shí)間及質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Molecular formula，retention time and MS parameters of nine uric acid regulation drugs

* quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

在電噴霧離子源的正離子和負(fù)離子模式下，分別對5 mg/L的9種待測物單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液作一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析。實(shí)驗(yàn)表明，9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物在兩種電離模式下均有響應(yīng)，正離子模式下可獲得[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，而負(fù)離子模式下可獲得[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰。但在負(fù)離子模式下，奧昔嘌醇和別嘌醇的質(zhì)譜響應(yīng)優(yōu)于正離子模式，且在負(fù)離子模式下為獲得較高的質(zhì)譜信號(hào)，需在流動(dòng)相中加入氨水等堿性添加劑，而較高的pH值又限制了色譜柱的選擇。綜合考慮，選用正離子模式作進(jìn)一步優(yōu)化，通過選擇離子監(jiān)測(SIM)優(yōu)化毛細(xì)管出口端電壓(Fragmentor)，獲得各化合物的母離子響應(yīng)最佳的碰撞電壓，然后對這些母離子作子離子全掃描分析，根據(jù)歐盟2006/657/EC決議中有關(guān)質(zhì)譜分析方法必須不少于4個(gè)識(shí)別點(diǎn)的規(guī)定[12]，為各待測物選取質(zhì)譜響應(yīng)最佳的兩個(gè)子離子作為特征碎片離子，通過MRM方式優(yōu)化碰撞能量使其響應(yīng)最佳。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。最終根據(jù)色譜保留時(shí)間和兩對MRM離子對的豐度比定性鑒別各組分，以MRM定量離子對的峰面積為依據(jù)進(jìn)行定量測定。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的極性跨度較大，由化學(xué)結(jié)構(gòu)式可知，別嘌醇和奧昔嘌醇的極性偏大，在反相色譜上保留極弱，而其他7種待測物的極性較適中，在反相色譜中有較好的保留。因此，應(yīng)側(cè)重于選用對極性化合物有較好保留的反相色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)比較了3款不同型號(hào)的色譜柱Poroshell 120 SB-C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)(色譜柱A)、XSelect?HSS T3(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)(色譜柱B)和Poroshell 120 Bonus-RP(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)(色譜柱C)的分離效果，結(jié)果表明：色譜柱A對奧昔嘌醇以及別嘌醇的分離效果較優(yōu)，但對丙磺舒、磺吡酮、阿鹵芬酯、雷西納德等的分離效果較差；色譜柱B和C均耐受100%水相環(huán)境，更適于分離極性化合物，但部分待測物在色譜柱B上的峰形拖尾。而色譜柱C對9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物尤其是別嘌醇和奧昔嘌醇均有較好的保留，且分離效果理想，峰形對稱、峰寬較窄，所以選擇Poroshell 120 Bonus-RP(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)作為本法的色譜分離柱。

2.2.2流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相及其添加劑對待測物的色譜保留行為、峰形和質(zhì)譜響應(yīng)均有較大影響。在選定的色譜柱上，以乙腈為有機(jī)相，分別考察了0.1%甲酸、0.1%乙酸、5 mmol/L甲酸銨、5 mmol/L乙酸銨、0.1%乙酸(含5 mmol/L甲酸銨)、0.1%甲酸(含5 mmol/L甲酸銨)、0.1%甲酸(含5 mmol/L乙酸銨)和0.1%乙酸(含5 mmol/L乙酸銨) 8種常用水相對待測物的分離情況。結(jié)果顯示，采用0.1%甲酸或0.1%乙酸作為水相時(shí)，質(zhì)譜響應(yīng)明顯增強(qiáng)，但前者的分離度變差，而后者的保留時(shí)間延長、峰形展寬；采用5 mmol/L乙酸銨或5 mmol/L甲酸銨作為水相時(shí)，質(zhì)譜響應(yīng)明顯減弱，化合物的分離效果變差。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，以0.1%乙酸(含5 mmol/L甲酸銨)為水相，乙腈為有機(jī)相，采用梯度洗脫，可以獲得最佳分離效果，且待測物的色譜峰拖尾明顯減少，但其質(zhì)譜靈敏度受到較大影響。綜合考慮，最終確定色譜分離條件見“1.4.1”，該條件下9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物均具有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，良好的色譜保留和色譜峰形。圖2為9種待測物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM定量離子對色譜圖。

圖2 9種調(diào)節(jié)尿酸類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM定量離子對色譜圖
Fig.2 MRM chromatograms of nine uric acid regulation drugs mixed standard solution

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

提取溶劑的選擇在樣品預(yù)處理中顯得尤為重要，而這又取決于目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)和樣品基質(zhì)[13]。本研究涉及的9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)雖然差別較大，但在甲醇、乙腈中均具有一定的溶解度。中成藥和保健食品多為酸性基質(zhì)，且多含氨基酸和糖苷等，此類物質(zhì)極性大，易溶于甲醇和水；而乙腈極性范圍寬，對多數(shù)化合物均具有較好的溶解性和較高的提取率，對糖、脂肪、蛋白質(zhì)化合物的提取率低，且分子小，組織穿透能力強(qiáng)[14]。因此，本研究分別考察了甲醇、水-甲醇、乙腈和水-乙腈作為提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明，以甲醇、水-甲醇作為提取溶劑，易將極性較大的物質(zhì)一并提取，造成較大的基質(zhì)干擾；用純乙腈作為提取溶劑時(shí)，部分待測物的提取回收率過低，而采用水-乙腈作為提取溶劑時(shí)，提取回收率明顯提高，且基質(zhì)影響不明顯，但將該提取液直接進(jìn)樣，會(huì)影響奧昔嘌醇和別嘌醇等強(qiáng)極性待測物的色譜峰形，出現(xiàn)峰分叉或前延，這主要由于進(jìn)樣溶液的有機(jī)相比例過高所致。因此，實(shí)驗(yàn)選擇水-乙腈為提取溶劑，采用先提取后用水稀釋的方法進(jìn)行樣品處理，可以得到較理想的提取效果和色譜峰形。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

與其他分析手段不同，質(zhì)譜分析尤其是電噴霧質(zhì)譜分析往往會(huì)存在基質(zhì)效應(yīng)(ME)[15-16]，影響方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度。本文采用提取后添加法對固體樣品(膠囊)及液體樣品(藥酒)進(jìn)行了基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)，用10%乙腈溶液、陰性固體基質(zhì)溶液及陰性液體基質(zhì)溶液分別配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測定，考察各待測物的基質(zhì)效應(yīng)(ME)。采用公式ME=B/A(B為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，A為純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)計(jì)算ME，結(jié)果見表2。其中ME比值越接近1，說明基質(zhì)效應(yīng)越小，反之亦然。由表2可知，除雷西納德的ME值偏低外，其他8種化合物ME值在0.86～1.11之間，呈弱基質(zhì)效應(yīng)，為消除或補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)給定量帶來的偏差，本文采用配制空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 線性范圍與檢出限

在優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件下，對6個(gè)質(zhì)量濃度水平的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以各組分的MRM定量離子對峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各待測物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995 7～0.999 9(見表2)。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法測定，以定量離子對的信噪比(S/N)≥3確定待測物的檢出限(LOD)，S/N≥10確定待測物的定量下限(LOQ)，得到9種化合物的LOD為0.03～0.6 mg/kg，LOQ為0.1～2.0 mg/kg，詳見表2。

表2 9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量下限及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，linear ranges，LODs，LOQs and matrix effects of nine uric acid regulation drugs

y:peak area;x:mass concentration，μg/L

2.6 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

取陰性固體樣品(膠囊)及陰性液體樣品(藥酒)，在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下分別進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平按“1.3”方法處理后平行測定6次，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(見表3)。結(jié)果顯示，方法的平均回收率為79.2%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為1.2%～12%，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，能滿足9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的測定要求。

表3 9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and RSDs of nine uric acid regulation drugs(n=6)

2.7 實(shí)際樣品的測定

采用所建方法對客戶委托送檢的12批次中成藥或保健食品(其中膠囊3批次、片劑1批次、顆粒5批次、丸劑2批次和藥酒1批次)進(jìn)行測定，均未檢出本文涉及的9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物。

3 結(jié) 論

本研究首次建立了LC-MS/MS同時(shí)快速測定中成藥和保健食品中9種非法添加尿酸調(diào)節(jié)類藥物的新方法。對樣品處理手段、色譜分離條件以及質(zhì)譜采集參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。方法操作簡單、快速、溶劑用量少、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為宣稱治療高尿酸血癥或具有抗痛風(fēng)功效的中成藥和保健食品中非法添加化學(xué)藥物的監(jiān)測提供技術(shù)支持。