正交試驗優(yōu)選白藜蘆醇納米囊泡處方

華芳

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230000)

王國平,施伶俐

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230000)

白藜蘆醇(Resveratrol)作為一種蒽醌萜類化合物，廣泛存在于天然植物中，如葡萄、虎杖等，具有抗炎、抗氧化、抗自由基等作用[1～5]，而白藜蘆醇在實際應(yīng)用中存在的缺陷有：①水溶性低，口服吸收差，生物利用度低。②在光、熱和氧化劑的作用下容易被氧化降解；在一定程度上限制了白藜蘆醇在醫(yī)藥和食品等行業(yè)中的應(yīng)用[6,7]。針對白藜蘆醇的口服吸收差和易被氧化降解的缺陷，尋找溫和、不良反應(yīng)小的藥物劑型來改善白藜蘆醇的水溶性和降低氧化降解，提高其生物利用度具有非常重要的意義[8]。目前，提高難溶性藥物的藥劑學(xué)手段有納米囊泡、納米混懸劑、微乳技術(shù)、分子包合技術(shù)、脂質(zhì)體技術(shù)、固體分散體等，其中納米囊泡可作為水溶性差的藥物載體，是一種具有組織相容性、細(xì)胞透過性的新型給藥系統(tǒng)，可將親水性或親脂性藥物包裹于其中，穩(wěn)定性較高，不易被氧化或水解。因此，本實驗以聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)作為載體材料，制備復(fù)合納米囊泡，以期通過載體材料的性質(zhì)提高白藜蘆醇的穩(wěn)定性，擴(kuò)大其應(yīng)用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紅外光譜儀：Thermo公司

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司

Waters Acquity UPLC H-Class 超高效液相色譜系統(tǒng)：美國Waters 公司

1.2 試藥

白藜蘆醇：薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%)。

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司(批號：R02J6S1)。

單甲氧基聚乙二醇(MePEG)：薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司(Mr=2000)。

二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

4-二甲氨基吡啶(DMAP)：阿拉丁試劑責(zé)任有限公司。

色譜純甲醇、乙腈：Merck公司。

其余均為分析純。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 納米材料的合成

根據(jù)洪偉勇[9]等的合成方法進(jìn)行改良合成。

1)聚乙二醇氰基乙酸酯(MePEGCA)的合成 將氰基乙酸、MePEG、DMAP適量加入三口瓶中，氮氣保護(hù)下，抽真空，加入無水二氯甲烷，攪拌溶解后，將溶有DCC的無水二氯甲烷注入三口瓶中，室溫攪拌24 h。抽濾，無水二氯甲烷洗滌濾渣，合并濾液，真空減壓濃縮，旋干至半固體，緩慢倒入3倍量的乙醚攪拌至溶解，-20℃過夜重結(jié)晶析出沉淀，得淺黃色固體，即為MePEGCA，真空干燥箱中干燥。

2)十六烷基氰基乙酸酯(HDCA)的合成 將氰基乙酸，十六醇及DMAP適量加入到的三口瓶中，氮氣保護(hù)下，抽真空，加入無水二氯甲烷，攪拌溶解后，將溶有DCC的無水二氯甲烷注入三口瓶中，室溫攪拌24 h。正己烷抽濾，洗滌濾液，濾液真空減壓濃縮，旋干至半固體，即為十六烷基氰基乙酸酯黃色粗品，經(jīng)柱層析分離，得十六烷基氰基乙酸酯白色固體，真空干燥箱中干燥。

3)聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)的合成 將HDCA和MePEGCA加入三口瓶中，氮氣保護(hù)下抽真空，加入20mL無水二氯甲烷和無水乙醇，攪拌至溶解后，將甲醛和吡咯烷緩慢注入三口瓶中，氮氣保護(hù)下，室溫攪拌24 h。真空減壓旋干，加入10%鹽酸溶液攪拌洗滌，無水二氯甲烷萃取三次，再用水洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，真空減壓濃縮，旋干得淡黃色蠟狀固體PEG-PHDCA粗品，經(jīng)柱層析分離，得淡黃色蠟狀固體PEG-PHDCA，真空干燥箱中干燥。

2.2 正交試驗優(yōu)選白藜蘆醇納米囊泡處方

圖1 PEG-PHDCA的紅外譜

1)白藜蘆醇納米囊泡的制備 采用薄膜分散水化超聲法制備：稱取司盤60(span 60)50mg、白藜蘆醇、膽固醇、PEG-PHDCA適量，置于圓底燒瓶中，加入氯仿/甲醇(V∶V=2∶1)混合溶液20mL，超聲溶解后，放入幾枚玻璃小珠，真空減壓旋干至半固體，真空干燥過夜。攪拌條件下加入水相30mL并在65 ℃下水化1h，超聲乳化8h(5min/次)后過濾，即得。

2)白藜蘆醇含量測定 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱( 100mm×2.1mm，1.7 μm) ；流動相為0.05%磷酸水溶液-乙腈(70∶30)；流速：0.2mL/min；檢測波長：306nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1μL。

由色譜圖可得，白藜蘆醇tR為2.841 min(如圖2所示)。

精密稱取白藜蘆醇對照品適量，用甲醇溶解，分別配制成22.0、44.0、66.0、88.0、110.0、132.0、154.0、176.0μg/mL的對照品液，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣。以色譜峰峰面積(A)為縱坐標(biāo)，白藜蘆醇質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=17523C-34411(r=0.9993)。結(jié)果表明，白藜蘆醇在22.0～176.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

圖2白藜蘆醇納米囊泡的UPLC色譜圖(A白藜蘆醇對照品， B白藜蘆醇納米囊泡)

表1 L9(34)正交設(shè)計因素水平表

取線性范圍內(nèi)的3種濃度，分別進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示RSD(%) <5%，表明本實驗方法穩(wěn)定可靠。

3)白藜蘆醇微囊包封率和載藥量的測定 取納米囊泡溶液適量，置截留分子量為10k的超濾管中，6000r/min離心10min，取超濾上清液注入測定游離藥物量。另取納米囊泡溶液適量加入乙腈溶解(V∶V=1∶3)，離心取上清液注入測定藥物總量。按下式計算包封率和載藥量：

包封率%=[(白藜蘆醇納米囊泡中藥物總量-未被包封的游離藥物量)/白藜蘆醇納米囊泡中藥物總量]×100%

載藥量%=(投藥量×包封率/白藜蘆醇納米囊泡總質(zhì)量)×100%

4)正交試驗優(yōu)選處方 在前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上，以投藥量(A)、膽固醇用量(B)、PEG-PHDCA(C)為影響因素，選取載藥量和包封率的綜合評分(綜合評分=0.5×載藥量+0.5×包封率)為評價指標(biāo)，確定正交試驗方案，因素與水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表 2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

F0.05(2,2) = 19.00; F0.01(2,2) = 99.00

由表2和表3中得出，白藜蘆醇納米囊泡處方影響因素的主次順序：A>C>B，即投藥量對白藜蘆醇納米囊泡制備的影響最大，PEG-PHDCA次之，膽固醇用量影響最小。白藜蘆醇納米囊泡制備的最佳工藝條件為 A3B1C1，即：投藥量為15mg，膽固醇用量為10mg，PEG-PHDCA用量為20mg。

5)驗證性試驗 按上述最佳工藝條件，進(jìn)行驗證試驗，白藜蘆醇納米囊泡的平均包封率(92.74 ± 0.27)%，載藥量(14.64 ± 0.04)%。

3 討論

本實驗在囊材的合成中MePEGCA和HDCA是最常見的酯化反應(yīng)，反應(yīng)中需要脫去水分，所以開始實驗前需要對試劑及儀器進(jìn)行干燥處理，達(dá)到盡可能的無水。為了提高合成PEG-PHDCA產(chǎn)量和純度，在前兩步的MePEGCA和HDCA合成中需要進(jìn)行一定的純化處理。白藜蘆醇納米囊泡的制備中發(fā)現(xiàn)超聲乳化時間對粒徑有較大的影響，通過對比發(fā)現(xiàn)超聲乳化8 h的粒徑會遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于超聲乳化6h。本實驗中未對改造后的白藜蘆醇納米囊泡的釋藥及藥理活性等進(jìn)行考察，后期需要進(jìn)一步研究探討。