枸杞花藥培養(yǎng)研究

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(1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 湖北 孝感 432000； 2.寧夏枸杞工程技術(shù)研究中心， 銀川 750004)

枸杞(LyciumLinn.)是名貴的藥食同源型植物?；ㄋ幣囵B(yǎng)在品種選育及遺傳分析中非常重要，顧淑榮等[1]以寧夏枸杞為試材，對取材時(shí)期、培養(yǎng)基、蔗糖濃度、激素濃度等作了探討，并獲得了單倍體植株。樊映漢等[2]以寧夏枸杞為試材，采取含單核晚期花粉的花藥培養(yǎng)，由胚狀體發(fā)育形成小植株。顧淑榮等[3]對枸杞未成熟的胚乳進(jìn)行培養(yǎng)獲得完整植株；曹有龍等[4]采用枸杞花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，建立細(xì)胞系，誘導(dǎo)植株再生。羅青等[5]對枸杞花藥胚狀體誘導(dǎo)的影響進(jìn)行了研究。本試驗(yàn)通過對枸杞愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率及根誘導(dǎo)率進(jìn)行研究，為今后的枸杞遺傳圖譜構(gòu)建、QTL標(biāo)記等遺傳學(xué)研究提供一個(gè)有價(jià)值的基礎(chǔ)材料群體。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料枸杞花蕾于2008年5—6月采自寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞研究中心枸杞種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗(yàn)方法

采集枸杞花萼綠色、花藥淡黃綠色的花蕾。剝?nèi)セㄝ?，在無菌條件下用1 mol/L HCl消毒1 min，用無菌水沖洗3次，在70%乙醇中消毒30 s，用無菌水沖洗3～4次，在0.1%HgCl2溶液中消毒8 min，再用無菌水沖洗3次，將花蕾置于已滅菌的濾紙上。用鑷子剝出花藥，去凈花絲，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，放在26 ℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)各處理愈傷組織數(shù)。出愈率(%)=愈傷組織塊數(shù)/接種花藥數(shù)×100%；采用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、多重比較。

1.2.1 激素配比濃度對枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基，生長素2,4-D和細(xì)胞分裂素6-BA組合，每種激素各5個(gè)水平：0，0.2，0.5，1.0，2.0 mg/L。培養(yǎng)基中添加0.8%瓊脂、5%蔗糖。研究激素配比濃度對枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。共25個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶。

1.2.2 接種密度對枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以100 mL三角瓶為培養(yǎng)容器，花藥接種在MS+KT 0.2 mg/L+IAA 2.0 mg/L+5%蔗糖+0.8%瓊脂培養(yǎng)基上； 1) 2蕾/瓶(10枚花藥)； 2) 4蕾/瓶(20枚花藥)； 3) 6蕾/瓶(30枚花藥)； 4) 8蕾/瓶(40枚花藥)； 5) 10蕾/瓶(50枚花藥)； 6) 12蕾/瓶(60枚花藥)； 7) 14蕾/瓶(70枚花藥)； 8) 16蕾/瓶(80枚花藥)； 9) 18蕾/瓶(90枚花藥)。共9個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶。

1.2.3 不同培養(yǎng)方式對枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以寧杞1號為試材，采用固體、液體、固液2層等3種培養(yǎng)方式，固體培養(yǎng)基采用MS+KT 0.2 mg/L+IAA 2.0 mg/L+5%蔗糖+0.8%瓊脂；液體培養(yǎng)基采用MS+KT 0.2 mg/L+IAA 2.0 mg/L+5%蔗糖；固液2層培養(yǎng)，采用下層是固體培養(yǎng)基30 mL，上層是液體培養(yǎng)基10 mL，共3個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶。

1.2.4 愈傷組織芽的分化

為進(jìn)一步誘導(dǎo)器官分化，將愈傷組織切成0.5 cm見方小塊，轉(zhuǎn)入含不同激素組合的MS分化培養(yǎng)基上，研究不同激素組合對枸杞花藥芽分化的影響。每瓶2～3塊愈傷組織，每處理接種50瓶。

1.2.5 生根培養(yǎng)

從芽基部切開，去除基部愈傷組織，轉(zhuǎn)入MS+6-BA 0.2 mg/L+3%蔗糖+0.8%瓊脂培養(yǎng)基中使其增殖，當(dāng)?shù)玫酱罅拷褵o根苗后，從基部切下，再轉(zhuǎn)入含不同濃度的激素MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。

2 結(jié)果與分析

2.1 花藥中產(chǎn)生愈傷組織和胚狀體的過程及特性

枸杞花粉發(fā)育成單倍體植株有2種途徑：一種是花藥中的花粉形成愈傷組織后分化出不定芽，再發(fā)育成植株；另一種是花藥中的花粉通過胚狀體階段發(fā)育為小植株?；ㄋ幵谡T導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后，大部分花藥開始膨脹， 花藥由淡綠色慢慢的變?yōu)闇\黃色，局部發(fā)生褐變。2周后，花藥由淺黃色變?yōu)樽睾稚?周后陸續(xù)在花藥壁上、花絲端部或花藥裂縫處長出愈傷組織(圖版Ⅰ，1)，有的在花藥開裂處長出綠色伸長的結(jié)構(gòu)即胚狀體，胚狀體進(jìn)一步發(fā)育，下胚軸伸長，長出葉片，發(fā)育長胚芽(圖版Ⅱ，12～15)，之后發(fā)育成具有根莖葉的再生植株(圖版Ⅱ，16～18)，有的顯現(xiàn)2片子葉(圖版Ⅱ，10～11)，子葉“帶帽”(實(shí)為花藥)(圖版Ⅱ，23)。

枸杞花藥誘導(dǎo)的愈傷組織主要有5種類型： 1) 灰白色或灰褐色、松軟濕潤、呈泥狀(圖版Ⅰ，4)，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)，分化出苗的頻率很低，大部分逐漸褐化死亡； 2) 淡黃色松散型(圖版Ⅰ，5)，這種類型的愈傷組織質(zhì)地松散、顆粒小、分散性能好，胚性細(xì)胞多、分化頻率高； 3) 黃白色質(zhì)地堅(jiān)硬緊密型(圖版Ⅰ，6)，質(zhì)地堅(jiān)硬，不易分散，經(jīng)過40 d的分化培養(yǎng)，只是體積增大，仍然保持黃白色不易分散，不易分化出苗； 4) 嫩綠色松散型(圖版Ⅰ，3)，一般都是從花藥開裂處長出，分化頻率較高； 5) 黃綠色、質(zhì)地較硬、生長緩慢及表面有顆粒突起的愈傷組織。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中超過50 d之后顆粒狀突起形成綠色的芽點(diǎn)直接分化出許多綠色的小苗(圖版Ⅰ，7)，無需轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基。除以上5種類型外，也有的愈傷組織是介于它們之間的過渡類型。實(shí)驗(yàn)中觀察到愈傷組織主要以第2種為主。有時(shí)在同一培養(yǎng)基中出現(xiàn)2種或2種以上類型的愈傷組織。

2.2 激素配比濃度對枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的方差分析

對2，4-D和6-BA組合所獲得的愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行極差分析，結(jié)果(表1)表明，2，4-D、6-BA和它們之間的交互作用均呈極顯著差異。根據(jù)F值的大小可知：一定濃度的2，4-D與6-BA配合使用對愈傷組織的誘導(dǎo)率比單獨(dú)使用影響更大。由于兩因素對愈傷組織的誘導(dǎo)能力呈顯著差異，故用LSD法對2，4-D 和6-BA激素配比濃度五水平進(jìn)行多重比較。

多重比較分析結(jié)果(表2，表3)表明，同一因素五水平之間的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率均有較大的差異，激素6-BA對枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，是隨著6-BA濃度的遞增而遞增。而激素2，4-D是隨濃度的遞增，其愈傷組織誘導(dǎo)率先增后降。6-BA五水平之間，濃度2.0 mg/L與其它4個(gè)濃度間呈極顯著差異，濃度1.0 mg/L和濃度0.5 mg/L間差異不顯著；2，4-D五水平之間，濃度1.0 mg/L與其它4個(gè)濃度間呈極顯著差異，濃度2.0 mg/L和濃度0.5 mg/L間差異不顯著。2，4-D 1.0 mg/L與6-BA 2.0 mg/L均獲得較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，因而MS+1.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA為較優(yōu)組合，這與試驗(yàn)中處理的結(jié)果相吻合[6]。

表1 激素配比濃度對枸杞花藥愈傷組織形成的影響試驗(yàn)結(jié)果方差分析

變異來源平方和自由度均方F值p值6-BA274.5040468.62608.0350**0.00092,4-D224.2080456.05206.5630**0.00256-BA×2,4-D136.6480168.540526.6890**0.0001誤差8.0000250.3200總變異643.360049

注：“**”表示0.01水平上顯著。

表2 激素配比濃度對枸杞花藥愈傷組織形成的影響中6-BA五水平多重比較

水平(mg/L)平均愈傷組織誘導(dǎo)率(%)5%顯著水平1%極顯著水平2.07.1600aA1.03.8400bB0.53.4600bB0.22.1400cC00.0000dD

表3 激素配比濃度對枸杞花藥愈傷組織形成的影響中2，4-D五水平多重比較

水平(mg/L)平均愈傷組織誘導(dǎo)率(%)5%顯著水平1%極顯著水平3.9800bB1.06.5000aA0.53.9800bB0.21.8800cC00.2600dD

2.3 接種密度對枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1所示，在不同的接種密度條件下愈傷組織誘導(dǎo)率有所不同，接種密度由10枚/瓶增加到50枚/瓶時(shí)，誘導(dǎo)率從0.6%猛增至4.5%，接種密度以50枚/瓶為佳。但當(dāng)超過50枚/瓶后，每瓶愈傷組織塊數(shù)在增加，但愈傷組織誘導(dǎo)率在下降。

注：1為花藥誘導(dǎo)出的愈傷組織；2為淡綠色愈傷組織；3為嫩綠色松散型的愈傷組織；4為灰白色或灰褐色、松軟濕潤、呈泥狀的愈傷組織；5為淡黃色松散型的愈傷組織；6為黃白色質(zhì)地堅(jiān)硬緊密型的愈傷組織；7為黃綠色或黃色、塊狀、質(zhì)地較硬、表面有顆粒狀突起的愈傷組織；8為分化前的愈傷組織；9為增殖的疏松愈傷組織；10為愈傷組織分化出綠點(diǎn)；11為分化出芽；12為生根培養(yǎng)；13為健壯的再生植株；14為白化苗；15為葉片發(fā)紫的再生植株。圖版Ⅰ 花藥愈傷組織形成和植株再生

注：1～3為胚狀體；4為分生出一片子葉胚狀體； 5為筒狀葉；6為棒狀； 7～9為扇形葉； 10-11為分生出2片子葉胚狀體；12～15為胚狀體形成的再生芽；16～18為分化出葉片和根的小植株；19為具有葉片和根的小植株，顯現(xiàn)2片子葉，子葉“帶帽”(實(shí)為花藥)；20為具有雙子葉特征的小植株。圖版Ⅱ 花藥胚狀體形成和植株再生

2.4 不同培養(yǎng)方式對枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示，在不同培養(yǎng)方式下花藥誘導(dǎo)率均不同，固體培養(yǎng)誘導(dǎo)率較高，為3.1%，固液2層培養(yǎng)花藥誘導(dǎo)出少量的愈傷組織和胚狀體，在液體培養(yǎng)條件下，花藥培養(yǎng)1周后沒有明顯膨脹，顏色由黃綠色漸漸轉(zhuǎn)為淺褐色，只誘導(dǎo)出極少量的愈傷。

表4 不同植物激素對枸杞愈傷組織分化頻率的影響

激素種類和濃度 (mg/L) 愈傷組織數(shù)(塊)再生植株的愈傷組織數(shù)(塊)分化頻率(%)特征6-BA2.01201411.7綠色,玻璃化芽多,生長差6-BA1.0120108.3綠色,玻璃化芽多,生長一般6-BA0.512086.7淡綠,芽正常,生長一般6-BA1.0+NAA0.51201310.8黃綠,芽正常,有愈傷組織產(chǎn)生6-BA0.5+NAA0.0112097.5黃綠,芽正常,生長旺盛6-BA0.5+NAA0.512054.2黃綠,芽正常,生長較差KT112000褐化KT1+NAA0.112000褐化死亡KT1+NAA0.512000白色緊密型愈傷組織

表5 不同植物激素對枸杞根形成的影響

激素種類和濃度(mg/L) 接種苗數(shù)根發(fā)生數(shù)根誘導(dǎo)率(%)不定根生長狀況6-BA1.0 1000NAA0.2 10880根多,粗壯IAA0.5 10330根少,纖細(xì)6-BA0.01+NAA0.210990根多,粗壯

圖1 不同接種密度對枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖2 不同培養(yǎng)方式對枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.5 愈傷組織芽的分化

選取直徑為1～3 mm的愈傷組織塊(圖版Ⅰ，8)接種在MS分化培養(yǎng)基中，分化培養(yǎng)1周后愈傷組織局部轉(zhuǎn)綠，2周后愈傷組織體積增殖3～5倍(圖版Ⅰ，9)，分化出綠色的芽點(diǎn)(圖版Ⅰ，10)，綠色的芽點(diǎn)2周左右分化成幼芽(圖版Ⅰ，11)，有的愈傷組織分化出玻璃化的葉片，有的愈傷組織不分化直接褐化死亡。從表4可以看出，6-BA濃度在1.0～2.0 mg/L時(shí)，每塊愈傷組織得苗數(shù)多，但玻璃化苗也多，濃度降至0.5 mg/L時(shí)，愈傷組織分化頻率略有下降，但分化出的苗正常。6-BA和NAA配合使用，能顯著提高愈傷組織的分化頻率，愈傷組織也得到了增殖。單獨(dú)添加KT或KT和NAA配合使用，未分化出芽。比較幾種培養(yǎng)基分化結(jié)果，以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L為最好。

2.6 根的形成

誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基上再生的芽要及時(shí)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，否則苗的基部又會(huì)轉(zhuǎn)化為愈傷組織。為了誘導(dǎo)根的發(fā)生，將芽轉(zhuǎn)入附加3%蔗糖和0.8%瓊脂、pH=6.0、含不同激素的MS生根培養(yǎng)基中，在含IAA和NAA的MS培養(yǎng)基上得到了具有根系的完整植株，從表5可以看出，其中以MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.01 mg/L的培養(yǎng)基效果最好。在試驗(yàn)中通過愈傷組織獲得部分無根苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中發(fā)紫，最后木質(zhì)化死亡。通過胚狀途徑獲得1株白化苗(圖版Ⅰ，14)；在后面的擴(kuò)繁過程中轉(zhuǎn)化成正常苗，雖然沒通過倍性鑒定，據(jù)有關(guān)資料顯示，這是典型單倍體特征。有的再生植株部分葉片發(fā)紫(圖版Ⅰ，15)，通過多次的擴(kuò)繁轉(zhuǎn)化為正常苗。通過多次的繼代和生根培養(yǎng)形成大量健壯的再生植株(圖版Ⅰ，13)。

3 討 論

激素在花藥培養(yǎng)中非常重要，在愈傷組織誘導(dǎo)過程中，雖然有僅用簡單的無機(jī)鹽和蔗糖培養(yǎng)基就可以誘導(dǎo)小孢子分裂的報(bào)道[7]，但對大多數(shù)植物來說，若不在基本培養(yǎng)基中添加激素，其小孢子將無任何反應(yīng)。根據(jù)前人研究，2，4-D作用強(qiáng)，可使小孢子的第1次均等分裂和具有均等核的花粉增多； 6-BA可以提高花粉胚狀體的產(chǎn)生和增強(qiáng)形成根的趨勢[8]。本次實(shí)驗(yàn)以寧杞1號為試材，進(jìn)行不同梯度2，4-D和6-BA組合實(shí)驗(yàn)，二者不同濃度配比對愈傷組織誘導(dǎo)率不同。其中2，4-D 1.0 mg/L和6-BA 2.0 mg/L為最佳的激素組合，在實(shí)驗(yàn)中獲得胚狀體較少，顧淑榮研究表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，胚狀體的誘導(dǎo)率高達(dá)16.9%[1]。與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異，其原因還有待進(jìn)一步研究。

接種密度也影響花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率， Fouletier和Michelloh最早在水稻的花藥培養(yǎng)中觀察到密度效應(yīng)，此后花藥培養(yǎng)的密度效應(yīng)在煙草、水稻和大麥中也有一些研究[9-11]?；ㄋ幟芏忍岣?，花藥本身釋放到培養(yǎng)基中的花藥因子也增加，只有當(dāng)花藥因子的濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，花藥愈傷組織才能形成[9]。本次實(shí)驗(yàn)中，接種密度50枚/瓶時(shí)花藥誘導(dǎo)率最高，接種密度在0～20枚/瓶或90枚/瓶時(shí)花藥誘導(dǎo)率非常低，可見接種密度過高或過低都會(huì)抑制花藥的愈傷組織。

通過合適的培養(yǎng)方式獲得最佳的通氣與營養(yǎng)吸收環(huán)境是花藥培養(yǎng)獲得成功的重要方面[12]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枸杞花藥固體培養(yǎng)基培養(yǎng)優(yōu)于其他培養(yǎng)方法。在固體培養(yǎng)中，花藥能較長時(shí)間的保持淡黃綠色，花藥膨脹形成愈傷組織，液體培養(yǎng)中花藥容易發(fā)生褐化，固液2層培養(yǎng)中花藥只誘導(dǎo)出少數(shù)的愈傷組織，可能是液體培養(yǎng)通氣不良造成的。

高濃度6-BA使枸杞花藥愈傷組織分化出的芽玻璃化，只有0.5 mg/L的6-BA和0.01 mg/L NAA配合使用，可以使枸杞花藥愈傷組織得到較好的分化。在少數(shù)愈傷組織上生成不定根，可能是培養(yǎng)基中添加NAA的緣故，NAA有促進(jìn)花藥愈傷組織生根的作用。0.2 mg/L NAA與0.01 mg/L 6-BA配合使用，枸杞生根效果比較理想。將無根苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其生根，待根須形成后，將莖切段轉(zhuǎn)入快繁培養(yǎng)基中，能有效控制玻璃化苗的出現(xiàn)。對于枸杞花藥培養(yǎng)所需的植物生長調(diào)節(jié)劑條件仍有待進(jìn)一步的研究。