涼都紅香椿外植體快繁體系的研究

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(1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院， 貴陽 551400；2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025)

香椿[Toonasinensis(A.Juss)Roem]屬楝科(Meliaceae)多年生落葉喬木，喜光照，在晝夜溫差較大且肥沃的沙質(zhì)土壤中生長較好[1]。香椿原產(chǎn)于我國中部，目前在全國很多地方已大面積栽培，主要分布在黃河流域和長江流域之間，尤其以河北和山東栽種面積最多[2]。香椿樹不僅作為良好的速生材，又是美味的木本蔬菜，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和食療價(jià)值[3]；研究表明，香椿葉含有多種生物活性物質(zhì)，如沒食子酸(gallic acid)、蘆丁(rutin)、槲皮苷(quercitin)、兒茶酚(catechin)、表兒茶酚(epicatechin)、棕櫚酸(palmitic acid)、油酸(oleic acid)、亞油酸(linoleic acid)、亞麻酸(linolenic acid)、β-谷甾醇混合物(a mixture ofβ-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、β-谷甾醇糖苷(β-sitosteryl-glucoside)、櫚酸乙酯(ethylgallate)、

二十碳酸乙酯、正二十六烷醇、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、5,7-二羥基-8-甲氧基黃酮、楊梅素、楊梅苷等，具有較高的藥用與保健價(jià)值[4]。盡管香椿作為食材兩用的優(yōu)良樹種具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但在自然條件下，其繁殖主要是通過播種、扦插育苗、埋根、分蘗等無性繁殖方法進(jìn)行[5]，而這些方法往往具有繁殖系數(shù)低、速度慢等缺點(diǎn)[6]。同時(shí)，香椿芽采收期短，受季節(jié)性影響明顯，僅限于春季的采收，因此傳統(tǒng)的栽培生產(chǎn)很難滿足生產(chǎn)需要，不利于快速繁殖和優(yōu)良品種的選育推廣栽培[7]。植物組織培養(yǎng)是快速繁育良種的重要策略手段之一，可實(shí)現(xiàn)植物的產(chǎn)業(yè)化種植和生產(chǎn)需要[8]。本研究以涼都紅香椿為材料，篩選獲得可用于紅香椿葉片外植體愈傷誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)基以及可促進(jìn)紅香椿枝條腋芽生長的培養(yǎng)基，旨在建立涼都紅香椿的再生快繁體系，為紅香椿的產(chǎn)業(yè)化種植、良種培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

涼都紅香椿(ToonasinensisRoem)實(shí)生苗(樹齡3～4年)和種子均由貴州歸園居農(nóng)業(yè)公司提供。枝條：于香椿適宜生長季節(jié)，選取當(dāng)年生半木質(zhì)化、腋芽健壯的枝條作為外植體。種子：挑選飽滿、大小一致的新鮮香椿種子作為無菌苗萌發(fā)材料。MS培養(yǎng)基購于Phytotech公司，萘乙酸(naphthylacetic acid，NAA)、6-芐基嘌呤(6-benzyl aminopurine，6-BA)、激動素(kinetin，KT)和噻苯隆(thidiazuron，TDZ)均購于Sigma-Aldrich公司。

1.2 方 法

1.2.1 植物外植體選擇

1) 無菌苗外植體獲得。挑選新鮮、飽滿的香椿種子用流水沖洗1 h后浸泡于蒸餾水中，37 ℃浸種24 h。之后依次經(jīng)75%酒精溶液消毒20 s，0.1%升汞溶液消毒8 min，無菌水沖洗4～6次后用無菌濾紙吸取多余水分，撒播于種子萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2 MS+0.5 mg/L GA3+0.05 mg/L NAA)上萌發(fā)培養(yǎng)。待無菌苗長出3～4片真葉時(shí)切下放置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

2) 成熟葉片及莖段外植體獲得。摘取4—6月香椿新發(fā)幼嫩葉片或當(dāng)年新萌發(fā)的幼嫩枝條(尚未木質(zhì)化)去掉可見葉，置于流水中沖洗30 min。將材料轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)，并依次用75%酒精和0.1%HgCl2消毒一定時(shí)間，再用無菌水沖洗4～6次，分別將無菌葉片切成0.5 cm2的小葉塊、無菌莖段材料剪成0.5～1.0 cm長的小莖段備用。分別接種外植體葉片愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2.2 愈傷誘導(dǎo)及植株再生

分別將上述無菌苗葉片切塊、下胚軸切段以及成熟組織小葉塊和莖段接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)至愈傷形成，每10～14 d繼代培養(yǎng)外植體1次。愈傷形成后轉(zhuǎn)至芽分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)至分化芽出現(xiàn)。選取長2～3 cm、長勢好的無菌苗，小心將其從愈傷組織上剝離，接入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.3 再生植株移栽

選取在生根培養(yǎng)基上生長至少有3～5條2.0 cm以上不定根的試管苗，在自然光條件下，封蓋煉苗3～5 d，再開蓋煉苗5～7 d，然后移栽到滅菌基質(zhì)上。自來水沖洗去苗基部的培養(yǎng)基，移栽到已滅過菌的不同比例的腐殖質(zhì)與碎爐渣的基質(zhì)中生長。前期適當(dāng)遮陰并保持濕度在85%～95%，逐步降至70%，15 d后去掉薄膜罩，定期噴灑40%多菌靈800倍液殺菌，5～7 d 1次，共計(jì)2～3次。

1.2.4 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，蔗糖含量30 g/L，生根誘導(dǎo)時(shí)不含大量元素且蔗糖減半，瓊脂7 g/L，pH=5.8，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光周期12 h/d。所有培養(yǎng)基在121 ℃下高溫滅菌20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑和消毒時(shí)間對葉片和枝條的影響

由表1可知，用0.1%HgCl2對香椿葉片消毒6～8 min時(shí)效果最佳，葉片死亡率和成活率分別為10.5%和87.4%。當(dāng)消毒時(shí)間超過8 min時(shí)，雖然葉片污染率降低，但葉片的成活率顯著下降，為27.9%。長時(shí)間的HgCl2處理不僅可有效滅殺微生物，同時(shí)對植物外植體本身的毒害作用也較大，導(dǎo)致外植體褐變并最終死亡。根據(jù)取材香椿葉片的老嫩程度，可選擇HgCl2處理時(shí)間為6～8 min。除了考慮成活率之外，低的死亡率也是組培成功的要素之一。因此，香椿葉片最佳的消毒劑和消毒時(shí)間為：75%酒精45 s、0.1%HgCl2(含2 d吐溫80)6～8 min；香椿枝條最佳的消毒劑和消毒時(shí)間為：75%酒精45 s、0.1%HgCl2(含2 d吐溫80)10～12 min。

表1 不同消毒劑和消毒時(shí)間對葉片的影響

消毒時(shí)間(min) 葉片 5%NaClO0.1%HgCl2污染率(%)死亡率(%)成活率(%)547.817.228.9822.110.587.4109.767.227.9571.315.819.4822.412.067.11010.777.618.8

表2 不同消毒劑和消毒時(shí)間對枝條的影響

消毒時(shí)間(min) 葉片 5%NaClO0.1%HgCl2污染率(%)死亡率(%)成活率(%)667.415.834.31226.09.378.81814.870.129.2673.822.218.51245.216.564.41821.265.832.7

2.2 不同培養(yǎng)基對枝條腋芽生長誘導(dǎo)及增殖的影響

以MS、1/2 MS為基本培養(yǎng)基，均附加0.2 mg/L GA3和0.02 mg/L NAA。培養(yǎng)30 d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)觀察，結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基上，接種的外植體腋芽萌發(fā)較早，生長快且葉色濃綠，效果較好，而1/2 MS培養(yǎng)基效果則相對較差，原因可能是營養(yǎng)元素減半對腋芽的生長不利(表3)。

表3 基本培養(yǎng)基對莖生長的影響

培養(yǎng)基處理樣本數(shù)平均每株分蘗數(shù)平均芽苗高(cm)萌芽時(shí)間(d)MS303.81.785～71/2MS301.70.927～9

2.3 不同培養(yǎng)基對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表3表明，2號培養(yǎng)基(MS+0.15 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L KT)對愈傷組織誘導(dǎo)的效果最好，誘導(dǎo)率高達(dá)92.8%，誘導(dǎo)時(shí)間最短(6 d)。4號培養(yǎng)基(MS+0.3 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L KT)的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為65.7%，且誘導(dǎo)時(shí)間也較長(10 d)。2號培養(yǎng)基(0.15 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L KT)雖然也能獲得最高的誘導(dǎo)率(86.8%)，但其愈傷組織結(jié)構(gòu)較為松散，且容易老化呈黃褐色，不利于再生芽的分化(表4)。

表4 不同培養(yǎng)基對愈傷誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基編號 培養(yǎng)基附加成分(mg/L) 愈傷組織誘導(dǎo) TDZNAAKT天數(shù)(d)誘導(dǎo)率(%)10.150.10.5965.620.150.31.0676.430.30.11.01056.840.30.30.51223.9

2.4 不同培養(yǎng)基對再生芽生根的影響

將高2.0 cm以上生長健壯的小苗，切除莖基部1～2 mm部分轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)1/2 MS+0.5 mg/L NAA對香椿的生根率效果最佳，可達(dá)90.9%，主根數(shù)為4.3根，根長平均為6.6 cm。5號培養(yǎng)基(MS+0.9 mg/L NAA)的生根率在5種培養(yǎng)基中最低，僅為21%，主根數(shù)為2.1根(表5)。

2.5 生根苗移栽

從表6可以看出，腐殖質(zhì)∶碎爐渣(1∶1)基質(zhì)的移栽成活率最高，香椿無菌苗移栽成活率達(dá)76.7%。比例為腐殖質(zhì)∶碎爐渣(2∶1)的基質(zhì)移栽成活率較低，以腐殖質(zhì)∶碎爐渣(3∶1)的基質(zhì)移栽成活率最低，僅為56.7%。

選取香椿葉片在篩選得到的最佳消毒條件以及最佳培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到長勢良好的香椿植株(圖1)。

3 討 論

香椿作為我國傳統(tǒng)的名貴木本蔬菜，除了色香味俱佳外，還含有豐富的營養(yǎng)成分[3]。香椿的傳統(tǒng)育種周期較長、繁育系數(shù)低、耗時(shí)費(fèi)力，嚴(yán)重阻礙了香椿產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展[9]。植物生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是細(xì)胞工程和基因工程理論和實(shí)踐的突破，為快速繁殖優(yōu)良品種、改良品種和培育新品種開辟了新的途徑[7]。目前，以植物細(xì)胞工程為基礎(chǔ)的植物組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛地應(yīng)用到花卉、藥用植物、農(nóng)林蔬菜經(jīng)濟(jì)作物的快速繁殖上，為推動農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化，增加國民經(jīng)濟(jì)收入起到了十分重要的作用[10]。本研究以香椿無菌苗、成熟葉片及幼嫩莖段為材料，通過配制不同培養(yǎng)基組合，優(yōu)化篩選了適于香椿愈傷組織誘導(dǎo)、幼芽分化及植株生根的培養(yǎng)基。同時(shí)對再生苗的移栽基質(zhì)及條件控制進(jìn)行探索，以期為快速培育涼都紅香椿、建立香椿種子苗圃及開發(fā)和利用香椿樹種，并最終推動地區(qū)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

表5 NAA的生根效應(yīng)

培養(yǎng)基編號NAA濃度(mg/L)處理樣本數(shù)生根株數(shù)生根率(%)每株平均生根條數(shù)10.1453373.32.820.3524280.83.530.5555090.94.340.7644570.33.350.9603456.72.1

表6 基質(zhì)對生根苗成活率的影響

基質(zhì)移栽株數(shù)(株)成活株數(shù)(株)成活率(%)腐殖質(zhì)∶碎爐渣(1∶1)655280腐殖質(zhì)∶碎爐渣(2∶1)583865.5腐殖質(zhì)∶碎爐渣(3∶1)623251.6

本研究可廣泛利用香椿無菌苗、成熟葉片及幼嫩莖段組織作為外植體進(jìn)行組培再生，具有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，外植體取材廣泛。前期研究表明，針對不同香椿外植體需要調(diào)整不同的培養(yǎng)，本研究針對不同來源的外植體材料均可采用相同的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基、幼芽分化培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；第二，愈傷組織分化率高。利用該培養(yǎng)基配方形成的愈傷組織色澤黃綠、結(jié)構(gòu)致密，利于后續(xù)的繼代及分化培養(yǎng)，與之前報(bào)道的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基相比，成分簡單，無需復(fù)雜的配方，大大節(jié)約成本；第三，重復(fù)性與普遍性高。對材料的處理方式統(tǒng)一，簡便，易重復(fù)。第四，經(jīng)濟(jì)效益高。通過組織再生實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本研究得出的培養(yǎng)基配方能較好地誘導(dǎo)愈傷組織分化出嫩芽，并最終形成完整的植株。同時(shí)，移栽過程中對基質(zhì)和環(huán)境條件的探索為提高香椿的移栽存活率提供了理論保障。

注：A為葉片培養(yǎng)；B為葉片繼代培養(yǎng)；C為葉片愈傷誘導(dǎo)；D為愈傷分化幼芽；E為植株再生。圖1 香椿組織培養(yǎng)