5個(gè)馬鈴薯新品系染色體構(gòu)型及遺傳差異的SSR分析

， ， 肖夏， ， ， ，

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特 010019)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)為茄科一年生具塊莖的作物，其糧、菜、飼兼用，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[1-3]。隨著我國(guó)主糧化戰(zhàn)略的深入實(shí)施，馬鈴薯在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的地位不斷提高。

新品種是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要基礎(chǔ)。隨著人民生活水平的不斷提高，對(duì)優(yōu)質(zhì)特色馬鈴薯新品種的需求呈增漲趨勢(shì)[4-6]。近幾年來(lái)，為培育適應(yīng)性強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的馬鈴薯新品種，根據(jù)遺傳差異大、優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)的親本選配原則，用生育期較短、花青素含量高的四倍體(2 n=4 x=48)彩色馬鈴薯品系‘彩異’和‘四彩’為母本，分別與適應(yīng)性強(qiáng)、干物質(zhì)和淀粉含量高的四倍體父本材料‘民Ⅱ’和‘隴薯7號(hào)’進(jìn)行雜交，通過(guò)對(duì)雜交后代優(yōu)良單株選育，獲得‘彩異×民Ⅱ’、‘四彩×民Ⅱ’和‘四彩×隴薯7號(hào)’3個(gè)雜交組合的5個(gè)優(yōu)良雜種新品系NNS-A 6、NNS-A 10、NNS-A 11、NNS-B 2和NNS-C 2。

表1 適宜SSR引物及其序列

引物名稱正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’) C5TACCTCTTGCTGACGTGGTGGCTCTTCCCTTCTGTGCATCS25GCGAATGACAGGACAAGAGGTGCCACTGCTACCATAACCAS7GACTGGCTGACCCTGAACTCGACAAAATTACAGGAACTGCAAAS151GCTGCTAAACACTCAAGCAGAACAACTACAAGATTCCATCCACAGS118AGAGATCGATGTAAAACACGTGTGGCATTTTGATGGATTS189CCTTGTAGTACAGCAGTGGTCTCCGCCAAGACTGATGCAS170CGCAAATCTTCATCCGATTCTCCGGCGGATAATACTTGTTSTM0030AGAGATCGATGTAAAACACGTGTGGCATTTTGATGGATTSTM0019aAATAGGTGTACTGACTCTCAATGTTGAAGTAAAAGTCCTAGTATGTGSTL003ACCATCCACCATGTCAATGCCTCATGGATGGTGTCATTGG

本試驗(yàn)以親本作對(duì)照，采用染色體制片法和SSR分子標(biāo)記技術(shù)[7-8]，重點(diǎn)對(duì)這5個(gè)新品系花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ(PMCMⅠ)的染色體配對(duì)行為和SSR指紋特征進(jìn)行分析，以明確新品系間的染色體構(gòu)型特征和DNA水平的遺傳差異，為下一步優(yōu)良新品種的育成登記和保護(hù)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為馬鈴薯優(yōu)良雜種新品系NNS-A 6、NNS-A 10、NNS-A 11和其親本‘四彩×民Ⅱ’，新品系NNS-B 2和其親本‘彩異×民Ⅱ’，新品系NNS-C 2和其親本‘四彩×隴薯7號(hào)’。種薯由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯遺傳育種研究所提供。各材料均種植在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)的網(wǎng)棚中，生長(zhǎng)期間適時(shí)適量灌水施肥，以滿足植株生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)水分和養(yǎng)分的需求，并及時(shí)防除病蟲(chóng)和雜草的危害。

1.2 方 法

1.2.1 染色體配對(duì)行為觀察

隨機(jī)取5個(gè)馬鈴薯雙親及其新品系的幼小花蕾(現(xiàn)蕾初期)，分別放在裝有卡諾液(無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1，0.5% FeCl3)的具塞試管中，黑暗條件下固定24 h后，清水沖洗花蕾，加入75%的酒精，置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。制片時(shí)，用解剖針將花藥中的花粉擠出，去掉花藥壁等雜質(zhì)，加1滴卡寶品紅溶液染色，蓋玻片后用鑷子均勻敲打并壓片。用40倍Olympus Corporation顯微鏡觀察各材料的染色體配對(duì)行為，選取染色體清晰、分散均勻的細(xì)胞統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目，并在100倍油鏡下照相[9]。

1.2.2 基因組DNA提取及檢測(cè)

在苗期隨機(jī)取各供試材

料的新鮮幼嫩葉片，用北京天根公司生產(chǎn)的試劑盒提取基因組DNA。每種材料吸取2μL DNA溶液，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度檢測(cè)，稀釋后置-40 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SSR-PCR反應(yīng)體系及程序

SSR反應(yīng)體系總體積為20μL，包含：1.0μL模板DNA(50 ng/μL)、上下游引物(0.5μmol/L)各0.7μL、2.0μL 10×PCR buffer(含Mg2+)、0.09μLTaqDNA聚合酶(5 U)、1.4μL dNTPs(0.225 mmol/L)和14.11μL ddH2O。試驗(yàn)所用生化試劑均購(gòu)自于北京全式金生物工程有限公司。

SSR-PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后樣品于4 ℃低溫保存。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

配置6% PAGE凝膠，變性擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量為5.5μL，于70 W恒定功率下電泳約1 h。將電泳后的膠板利用銀染法進(jìn)行染色：置于固定液(1 800 mL蒸餾水+20 mL冰乙酸+200 mL酒精)中10 min，取出經(jīng)蒸餾水漂洗約2 min后，再置于2.0%的硝酸銀溶液中染色10 min，再用蒸餾水迅速漂洗5 s后，于顯影液中顯色，膠板置于室內(nèi)晾干并掃描照相[10]。

1.2.5 適宜引物篩選

本試驗(yàn)從100對(duì)馬鈴薯SSR引物中(NCBI網(wǎng)站公布，委托上海生物工程有限公司合成)篩選出多態(tài)性好、條帶穩(wěn)定清晰的10對(duì)SSR適宜引物(表1)，用于馬鈴薯親本及其5個(gè)新品系的SSR分析。

1.2.6 SSR多態(tài)性統(tǒng)計(jì)

采用0/1賦值法，對(duì)擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，無(wú)帶記為“0”，有帶記為“1”，生成“0”、“1”矩陣。若擴(kuò)增位點(diǎn)沒(méi)有多態(tài)性，則只記錄對(duì)該引物的擴(kuò)增條帶總數(shù)[11]。多態(tài)性條帶百分率(簡(jiǎn)稱P)：P=(具有多態(tài)性的條帶數(shù)目/擴(kuò)增條帶總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯新品系染色體構(gòu)型比較

從圖1和表2可知，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ(PMCMⅠ)時(shí)，馬鈴薯雙親及其各品系間的單價(jià)體、二價(jià)體、三價(jià)體和四價(jià)體的頻率變幅分別為1.95～8.27、9.26～15.46、1.35～4.43和1.98～2.83，這表明5個(gè)新品系及其親本的PMCMⅠ染色體配對(duì)行為有一定差異。母本‘彩異’和‘四彩’的染色體構(gòu)型分別為2 n=4 x=48=9.17 Ⅰ+8.95 Ⅱ+4.55 Ⅲ+1.82 Ⅳ和2 n=4 x=48=3.54 Ⅰ+12.77 Ⅱ+2.65 Ⅲ+2.74 Ⅳ；父本‘隴薯7號(hào)’和 ‘民Ⅱ’分別為2 n=4 x=48=2.32 Ⅰ+14.15 Ⅱ+1.94 Ⅲ+2.89 Ⅳ和2 n=4 x=48=7.85 Ⅰ+10.89 Ⅱ+3.73 Ⅲ+1.79 Ⅳ；5個(gè)新品系NNS-C 2、NNS-A 6、NNS-A 10、NNS-B 2和NNS-A 11的染色體配對(duì)構(gòu)型依次分別為2 n=4 x=48=1.95 Ⅰ+15.46 Ⅱ+1.35 Ⅲ+2.77 Ⅳ、2 n=4 x=48=5.66 Ⅰ+11.47 Ⅱ+3.6 Ⅲ+2.15 Ⅳ、2 n=4 x=48=2.98 Ⅰ+13.54 Ⅱ+2.2 Ⅲ+2.83 Ⅳ、2 n=4 x=48=8.27 Ⅰ+9.26 Ⅱ+4.43 Ⅲ+1.98 Ⅳ和2 n=4 x=48=3.47 Ⅰ+12.13 Ⅱ+3.21 Ⅲ+2.66 Ⅳ。

注：a為品系NNS-A 6；b為品系NNS-A 10；c為品系NNS-A 11；d為品系NNS-B 2；e為品系NNS-C 2；f為♀四彩；g為♀彩異；h為♂民Ⅱ；i為♂隴薯7號(hào)。圖1 馬鈴薯新品系及其親本的染色體配對(duì)行為

表2 馬鈴薯新品系及其親本染色體配對(duì)構(gòu)型

材料觀察細(xì)胞數(shù)單價(jià)體Ⅰ二價(jià)體Ⅱ三價(jià)體Ⅲ四價(jià)體Ⅳ品系NNS-C2265 1.9515.461.352.77品系NNS-A6242 5.6611.473.62.15品系NNS-A10257 2.9813.542.22.83品系NNS-B2249 8.279.264.431.98品系NNS-A11260 3.4712.133.212.66♀彩異236 9.178.954.551.82♀四彩255 3.5412.772.652.74♂隴薯7號(hào)252 2.3214.151.942.89♂民Ⅱ268 7.8510.893.731.79

2.2 新品系遺傳差異的SSR分析

從圖2-A看出，5個(gè)馬鈴薯新品系及其親本的基因組DNA電泳條帶穩(wěn)定、均勻清晰、無(wú)彌散和拖尾現(xiàn)象，表明提取的各材料DNA純度很高，可進(jìn)行SSR分子標(biāo)記電泳分析。

由表3可知，用篩選出的10對(duì)多態(tài)性引物對(duì)馬鈴薯親本雙親及其5個(gè)優(yōu)良新品系的基因組DNA進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，共得到128個(gè)清晰穩(wěn)定的SSR條帶，其中多態(tài)性條帶106個(gè)，多態(tài)性比率占82.81%。

注：A為DNA 純度檢測(cè)；B為引物S189；C為引物S25；D為引物STM 0030。M為DL 2000；1為品系NNS-A 6；2為品系NNS-A10；3為品系NNS-A 11；4為品系NNS-B 2；5為品系NNS-C 2；6為♀四彩；7為♀彩異；8為♂民Ⅱ；9為♂隴薯7號(hào)。圖2 5個(gè)馬鈴薯新品系和親本基因組DNA純度檢測(cè)結(jié)果及用3對(duì)特異性引物PCR擴(kuò)增的SSR指紋圖

本試驗(yàn)從10對(duì)SSR適宜引物中選出能在DNA水平上清晰地區(qū)分各新品系及其親本的3對(duì)SSR引物S 189、S 25和STM 0030，經(jīng)PCR擴(kuò)增建立了5個(gè)新品系的SSR指紋圖(圖2-B、C、D)，這為下一步新品種的育成登記和保護(hù)利用提供了分子依據(jù)。

表3 新品系及其親本的SSR擴(kuò)增結(jié)果

引物名稱多態(tài)性條帶擴(kuò)增條帶總數(shù)多態(tài)性比率(%)C581172.73S25131492.86S7101376.92S15181172.73S118111478.57S1891010100.00S170121580.00STM003091275.00STM0019a131586.67STL003121392.31總數(shù)10612882.81(均值)

3 討 論

染色體是DNA遺傳物質(zhì)的載體，觀察染色體配對(duì)行為是在細(xì)胞學(xué)水平上了解不同作物遺傳差異的基礎(chǔ)，對(duì)作物雜交育種研究具有重要理論指導(dǎo)意義[12]。研究表明，當(dāng)植物染色體構(gòu)型中的二價(jià)體頻率較高時(shí)，其花粉可育率較高，而單價(jià)體或多價(jià)體頻率較高時(shí)，花粉可育率常較低[13]。其原因是二價(jià)體頻率高，同源染色體可以正常聯(lián)會(huì)，因而花粉育性也高；而單價(jià)體或多價(jià)體頻率高，常會(huì)引起聯(lián)會(huì)的同源染色體不均衡分離，造成染色體配對(duì)異常，花粉育性降低[14]。本試驗(yàn)從‘彩異×民Ⅱ’、‘四彩×民Ⅱ’和‘四彩×隴薯7號(hào)’這3個(gè)雜交組合的雜種F1分離群體中，選育出的5個(gè)馬鈴薯優(yōu)良新品系NNS-C 2、NNS-A 6、NNS-A 10、NNS-B 2和NNS-A 11的染色體配對(duì)構(gòu)型數(shù)據(jù)結(jié)果與前人在其他作物上的研究結(jié)果一致。如新品系NNS-C 2的二價(jià)體頻率較高(15.46)，而單價(jià)體和多價(jià)體頻率相對(duì)較低(1.95)；新品系NNS-B 2的二價(jià)體頻率較低(9.26)，而單價(jià)體和多價(jià)體頻率較高(8.27)。這為今后5個(gè)新品系作為中間材料進(jìn)一步用于雜交改良利用提供了可靠的細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。

SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性好、電泳條帶穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單及成本較低等優(yōu)點(diǎn)，呈遺傳共顯性，很適合于作物雜交后代的鑒定[15-16]。本試驗(yàn)利用篩選出的10對(duì)SSR多態(tài)性適宜引物，對(duì)馬鈴薯親本材料及其5個(gè)優(yōu)良新品系的基因組DNA進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增得到多態(tài)性條帶106個(gè)，多態(tài)性比率高達(dá)82.81%，這說(shuō)明供試材料間的遺傳差異較大。試驗(yàn)還利用3對(duì)SSR特異性引物S 189、S 25和STM 0030，PCR擴(kuò)增建立了能識(shí)別各新品系和其親本的SSR指紋圖，再次表明SSR分子標(biāo)記技術(shù)用于馬鈴薯新品系的鑒定是可靠的。

4 結(jié) 論

1) 5個(gè)馬鈴薯新品系NNS-C 2、NNS-A 6、NNS-A 10、NNS-B 2和NNS-A 11的染色體構(gòu)型，依次分別為1.95 Ⅰ+15.46 Ⅱ+1.35 Ⅲ+2.77 Ⅳ、5.66 Ⅰ+11.47 Ⅱ+3.6 Ⅲ+2.15 Ⅳ、2.98 Ⅰ+13.54 Ⅱ+2.2 Ⅲ+2.83 Ⅳ、8.27 Ⅰ+9.26 Ⅱ+4.43 Ⅲ+1.98 Ⅳ和3.47 Ⅰ+12.13 Ⅱ+3.21 Ⅲ+2.66 Ⅳ。

2) 篩選出適用于5個(gè)優(yōu)良新品系及其親本基因組DNA多態(tài)性分析的SSR適宜引物10對(duì)，并明確了各新品系在DNA水平上的遺傳差異，建立了新品系及其親本的SSR指紋圖。