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(貴陽中醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽 550002)
表1 樣品產(chǎn)地信息
樣品號產(chǎn)地詳情 樣品號產(chǎn)地詳情 S1貴陽市烏當(dāng)區(qū)水田鎮(zhèn)S18畢節(jié)市織金縣馬場鄉(xiāng)獅子山S2龍里縣灣寨鄉(xiāng)姨媽寨S19畢節(jié)市黔西縣新坪村S3貴陽市花溪區(qū)燕樓鄉(xiāng)S20大方縣大海壩森林公園S4貴陽市烏當(dāng)區(qū)永樂鄉(xiāng)羊角村S21畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)大石關(guān)S5長順縣營盤鎮(zhèn)S22貴陽市南明區(qū)冒沙井苦月節(jié)山S6石阡縣本莊鎮(zhèn)喬牌村S23松桃縣婆洞村S7石阡縣聚鳳鄉(xiāng)指甲平村S24印江縣峨嶺鎮(zhèn)普同村S8貴陽市烏當(dāng)新場鎮(zhèn)大橋村五保塘S25江口縣唐古坡(省道旁)S9貴陽市修文縣六屯鎮(zhèn)獨山村S26凱里市金山大道旁S10習(xí)水縣沔山村新村S27凱里市三棵樹鎮(zhèn)S11安龍縣灑雨鎮(zhèn)S28凱里市麻江縣壩芝鄉(xiāng)S12貞豐縣珉谷鎮(zhèn)S29麻江縣谷兵村S13興義市興仁縣榜榜田S30貴定縣治山鎮(zhèn)國道旁S14遵義市紅花崗區(qū)袁家寨大橋附近S31安順市普定縣S15遵義市匯川區(qū)團澤鎮(zhèn)付家灣S32安順市西秀區(qū)武當(dāng)路S16綏陽縣旺草鎮(zhèn)蘿柏小學(xué)附近S33紫云苗族布依族自治縣貓營鎮(zhèn)龍場村S17綏陽縣大路槽鄉(xiāng)園子S34貴陽市花溪區(qū)黔陶高坡鄉(xiāng)
淫羊藿屬于小檗科植物,具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效,用于腎陽虛衰、陽痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣等癥,是使用最為悠久、應(yīng)用最為廣泛的中藥之一。最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注[1-2]?,F(xiàn)代研究表明,淫羊藿尚有增強免疫、抗衰老、抗腫瘤、抗艾滋病等作用,常用于治療骨質(zhì)疏松、更年期綜合癥、乳房腫塊、高血壓、冠心病等疾病,因而具有巨大的研究和開發(fā)潛力[3-7]。而粗毛淫羊藿(EpimediumacuminaumFranch.)是我國西南地區(qū)淫羊藿藥材使用種類的代表,因其藥材中淫羊藿苷的含量較高,為貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所收載,現(xiàn)已成為貴州淫羊藿藥材的主流品種之一,亦作為貴州省少數(shù)民族用藥[8-11]。
近年來,隨著中醫(yī)藥文化的發(fā)展,對淫羊藿需求也在不斷擴大,造成了品種混亂、品質(zhì)參差不齊的現(xiàn)象,而淫羊藿藥材化學(xué)成分復(fù)雜,目前多以淫羊藿苷為指標(biāo)評價其質(zhì)量,但檢測成分過于單一,不能較全面反映其他成分的情況,難以真正控制其質(zhì)量。本研究采用HPLC法建立粗毛淫羊藿的指紋圖譜,并結(jié)合聚類分析和主成分分析對不同產(chǎn)地藥材進行評價,以期有效利用資源、減少藥材產(chǎn)地帶來的質(zhì)量差異、篩選質(zhì)量評價指標(biāo)成分,為淫羊藿藥材的鑒定和質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。
Thermo Fisher高效液相色譜儀(包括DAD檢測器,UV檢測器,自動進樣系統(tǒng),Thermo chromeleon 7色譜工作站),Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18色譜柱(3.0 mm×100 mm,2.7μm),AG 135型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司);SG 8200 HPT型數(shù)控超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司),DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。
無水乙醇、甲醇為分析純(天津富宇精細(xì)化工有限公司),實驗用水為重蒸餾水,乙腈、甲醇為色譜純(美國TEDIA)。
34批樣品均由本課題組野外采集,并經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院王悅云副教授鑒定為粗毛淫羊藿(EpimediumacuminaumFranch.),葉片陰干打粉過3號篩備用。產(chǎn)地詳情見表1。對照品為課題組前期所購買,包括朝藿定A對照品(批號MUST-13040209,純度為99.40%),朝藿定B對照品(批號MUST-13062312,純度≥98%),均購于北京神州科創(chuàng)生物科技有限公司;淫羊藿苷對照品(批號110737-200312)、朝藿定C對照品(批號為110756-200110)購于中國藥品生物制品檢定所[13]。
取淫羊藿藥材粉末0.2 g,精密稱定,置于50 mL具塞三角燒瓶中,精密加入50%乙醇溶液20 mL,稱定重量,超聲處理40 min(功率100 W,頻率40 Hz),冷卻至常溫,用50%乙醇溶液補足所失重量,搖勻過濾,過0.22μm有機微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。
Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18色譜柱(3.0 mm×100 mm,2.7μm),流動相為乙腈(B)-水(C),梯度洗脫0~5 min:25%~26%(B);5~6 min:26%~34%(B);6~11 min:34%~38.5%(B);11~17 min:38.5%~100%(B);17~20 min:100%(B)。進樣量10μL,檢測波長270 nm,流速0.8 mL/min,柱溫30 ℃。
2.3.1 空白試驗
為考察溶劑及流動相對淫羊藿指紋圖譜的影響,取50%乙醇溶液,按“2.2”色譜條件進行測定。結(jié)果空白試驗圖譜基線平穩(wěn),表明試劑及流動相對淫羊藿指紋圖譜測定沒有干擾。
(平均數(shù)法,時間窗寬度為0.5)圖1 34批不同產(chǎn)地粗毛淫羊藿指紋圖譜疊加
2.3.2 完整性試驗
取S 13號樣品,按“2.1”的條件制備供試品溶液,按“2.2”色譜條件進行測定。為考察特征圖譜記錄的完整性,記錄20 min后,以梯度結(jié)束時的流動相比例繼續(xù)洗脫,并記錄色譜圖至60 min。結(jié)果色譜圖在20 min后未出現(xiàn)色譜峰,表明采集20 min色譜圖可基本記錄完整淫羊藿藥材化學(xué)成分信息。
2.3.3 精密度試驗
取S 13號樣品,按“2.1”的條件制備供試品溶液,按“2.2”色譜條件進行測定,連續(xù)進樣6次。記錄色譜圖,并計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結(jié)果各共有峰相對峰面積RSD在0.78%~1.76%之間,各共有峰相對保留時間的RSD在0.01%~1.13%之間;將6次進樣所得圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004.A版)軟件(以下簡稱相似度軟件)進行處理,與對照圖譜相似度均大于0. 99,表明儀器精密度良好。
2.3.4 重復(fù)性試驗
平行取S 13號樣品6份,按“2.1”的條件制備供試品溶液6份,按“2.2”色譜條件分別進樣分析,測得各共有峰的相對峰面積RSD在0.8%~2.85%之間,各共有峰的相對保留時間的RSD在0.01%~0.97%之間;將6份樣品圖譜導(dǎo)入相似度軟件進行處理,與對照圖譜的相似度均大于0.99,說明所用方法重復(fù)性良好。
2.3.5 穩(wěn)定性試驗
取S 13號樣品,按“2.1”的條件制備供試品溶液,按“2.2”色譜條件進行測定,分別在第0,1,2,4,8,12,24,36,48小時進樣,記錄其色譜圖,并計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。各共有峰相對峰面積RSD在0.92%~2.92%之間,各共有峰相對保留時間的RSD在0.01%~0.97%之間;將所得圖譜導(dǎo)入相似度軟件進行處理,與對照圖譜相似度大于0.98,表明供試品溶液在48 h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定。
2.4.1 指紋圖譜的建立及相似度評價
取34批不同產(chǎn)地粗毛淫羊藿樣品按照“2.1”方法制備成供試品溶液,于“2.2”色譜條件進行檢測。將所得色譜圖分別導(dǎo)入相似度軟件進行處理。得到34批粗毛淫羊藿指紋圖譜疊加,見圖1。藥材的共有模式圖譜見圖2。以S 13的指紋圖譜為參照圖譜,對S 1~S 34的指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進行多點校正并自動匹配,設(shè)定時間窗寬度為0.5,按中位數(shù)法生成對照圖譜,共標(biāo)定20個共有峰,其中1號,2 號,3號,5號峰分別與朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷對照品保留時間相一致(混合對照品圖譜見圖3)。各共有峰相對保留時間的RSD在0.02%~0.64%之間,各共有峰的相對峰面積RSD值在34.98%~255.96%之間。計算34批粗毛淫羊藿指紋圖譜相似度,結(jié)果各產(chǎn)地與對照圖譜相似度在0.606~0.959之間。
2.4.2 聚類分析
將34批樣品指紋圖譜中的20個共有峰峰面積z-score標(biāo)準(zhǔn)化,形成34×20階數(shù)據(jù)矩陣,導(dǎo)入SPSS 16.0軟件進行Q型聚類分析。運用組間連接法進行系統(tǒng)聚類分析,其中樣品間距離的計算采用歐氏平方距離法,聚類結(jié)果見圖4。
圖2 粗毛淫羊藿藥材的共有模式圖譜
注:A為朝藿定A;B為朝藿定B;C為朝藿定C;D為淫羊藿苷。圖3 混合對照品色譜圖
圖4 34批不同產(chǎn)地粗毛淫羊藿藥材的聚類樹狀圖
產(chǎn)地S 1和S 24首先被分出來聚為一類,在歐式平方距離為15時,產(chǎn)地S 12,S 18,S 13,S 11,S 31,S 27,S 26聚為一類,其他聚為一類,在歐式平方距離為10時,聚類趨勢可分為6類,第1類為S 1和S 34,第2類為S 12,S 18,S 13,S 11,第3類為S 31,S 27,S 26,第4類為S 25,S 32,S 24,S 23,S 30,S 22,S 7,S 6,第5類為S 33,S 28,S 29,第6類為S 9,S 2,S 8,S 4,S 5,S 3,S 14,S 10,S 19,S 21,S 20,S 15,S 16,S 17。
2.4.3 主成分分析
用SPSS 16.0軟件對34個貴州不同產(chǎn)地粗毛淫羊藿藥材的20個變量(共有峰峰面積)原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理,以主成分的特征值及貢獻率為依據(jù),進行主成分因子分析,計算相關(guān)系數(shù)矩陣,主成分特征值、累積貢獻率并計算主成分綜合得分[13],對各產(chǎn)地粗毛淫羊藿品質(zhì)進行評價。
根據(jù)因子分析結(jié)果可得總方差解釋表,對各變量進行因子提取和因子旋轉(zhuǎn)的結(jié)果見表2。
根據(jù)各因子特征值大于1的原則及因子的方差累計貢獻率達到85% 以上作為主成分提取的標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合表2,本試驗需要提取的主成分主要有5個,其中提取主成分1的特征值為6.052,其貢獻率為30.259%;提取主成分2的特征值為5.082,貢獻率為25.408%;提取主成分3的特征值為3.753,貢獻率為18.767%;提取主成分4的特征值為1.735,貢獻率為8.677%,提取主成分5的特征值是1.099,貢獻率為5.496%。這5個主成分的累積方差總貢獻率達到88.607%,因此提取前5個主成分進行分析較為合適,即前5個主成分可以反映整體指標(biāo)88.607%的信息。
根據(jù)因子分析可得成分矩陣,為了使提取的主成分能夠更加清晰、集中、全面地反映原始數(shù)據(jù)所包含的內(nèi)容,需要進行正交旋轉(zhuǎn)[14],得到20個指標(biāo)在5個主成分中的旋轉(zhuǎn)成分矩陣,結(jié)果見表3。
每個樣本都是由數(shù)個變量屬性特征構(gòu)成的,這些屬性特征之間的關(guān)系,則可以利用載荷圖來對圖像特征進行描述,載荷的絕對值越大,對于主成分的影響就越大,而這種影響可以通過載荷所代表的點到原點之間的距離來衡量。見圖5。
表2 總方差解釋變異量
成分 初始特征值 提取平方和載入 旋轉(zhuǎn)平方和載入 合計方差(%)累計(%)合計方差(%)累計(%)合計方差(%)累計(%)16.05230.25930.2596.05230.25930.2594.94724.73424.73425.08225.40855.6675.08225.40855.6674.6223.10247.83533.75318.76774.4343.75318.76774.4344.00520.02467.85941.7358.67783.1111.7358.67783.1112.18110.90678.76551.0995.49688.6071.0995.49688.6071.9689.84288.60760.6133.06791.67470.4172.08793.76180.3391.69795.45890.3111.55597.013100.1450.72497.737110.1190.59798.335120.090.44898.782130.0640.32199.103140.0540.27199.374150.0420.2199.584160.030.1599.734170.0220.11199.845180.0170.08799.933190.0090.04599.978200.0040.022100
表3 成分矩陣
共有峰主成分12345Zscore(F1)0.5640.4880.4660.079-0.423Zscore(F2)0.7820.3340.4550.034-0.096Zscore(F3)0.706-0.0110.249-0.3510.479Zscore(F4)0.3280.4990.31-0.631-0.022Zscore(F5)0.8320.1290.3150.322-0.13Zscore(F6)0.8190.0610.4960.0530.077Zscore(F7)0.701-0.1870.452-0.0140.224Zscore(F8)0.651-0.2260.3950.5140.06Zscore(F9)-0.0910.48-0.1920.7080.158Zscore(F10)-0.0660.926-0.079-0.043-0.294Zscore(F11)0.0750.861-0.181-0.149-0.387Zscore(F12)0.0280.835-0.226-0.0470.461Zscore(F13)0.0150.787-0.3240.3840.156Zscore(F14)-0.1010.912-0.171-0.0020.226Zscore(F15)-0.4060.5970.38-0.1860.212Zscore(F16)-0.7820.0010.5060.2130.003Zscore(F17)-0.5660.0410.609-0.026-0.058Zscore(F18)-0.60.10.680.1930.081Zscore(F19)-0.5840.1490.73-0.160.016Zscore(F20)-0.6420.0940.6620.1350.035
圖5 粗毛淫羊藿共有峰指紋圖譜投影
主成分1方差貢獻率最大,為30.259%,是最重要的成分群,結(jié)合表3和圖4,以X軸為例,在投影圖中選取距離原點較遠(yuǎn)的幾個點,主成分1中的信息主要來自色譜峰2、3、5、6、16號,其中2號共有峰為朝藿定B,3號共有峰為朝藿定C,5號共有峰為淫羊藿苷,6號共有峰和16號共有峰為未知物質(zhì)峰。
2.4.4 基于主成分分析建立貴州產(chǎn)粗毛淫羊藿質(zhì)量綜合評價模型
根據(jù)表2和表3,以X1、X2、X3、X4、X5代表5個主成分來作為34批不同產(chǎn)地粗毛淫羊藿成分所表達的信息,建立其品質(zhì)的評價模型,得出成分的線性關(guān)系表達式分別為:
圖6 產(chǎn)地綜合得分分布
X1=0.564F1+0.782F2+0.706F3+0.328F4+0.832F5+0.819F6+0.701F7+0.651F8-0.091F9-0.066F10+0.075F11+0.028F12+0.015F13-0.101F14-0.406F15-0.782F16-0.566F17-0.6F18-0.584F19-0.642F20
X2=0.488F1+0.334F2-0.011F3+0.499F4+0.129F5+0.061F6-0.187F7-0.226F8+0.48F9+0.926F10+0.861F11+0.835F12+0.787F13+0.912F14+0.597F15+0.001F16+0.041F17+0.1F18+0.149F19+0.094F20
X3=0.466F1+0.455F2+0.249F3+0.31F4+0.315F5+0.496F6+0.452F7+0.395F8-0.192F9-0.079F10-0.181F11-0.226F12-0.324F13-0.171F14+0.38F15+0.506F16+0.609F17+0.68F18+0.73F19+0.662F20
X4=0.079F1+0.034F2-0.351F3-0.631F4+0.322F5+0.053F6-0.014F7+0.514F8+0.708F9-0.043F10-0.149F11-0.047F12+0.384F13-0.002F14-0.186F15+0.213F16-0.026F17+0.193F18-0.16F19+0.135F20
X5=-0.423F1-0.096F2+0.479F3-0.022F4-0.13F5+0.077F6+0.224F7+0.06F8+0.158F9-0.294F10-0.387F11+0.461F12+0.156F13+0.226F14+0.212F15+0.003F16-0.058F17+0.081F18+0.016F19+0.035F20
(注:表達式中各變量不是原始變量,而是標(biāo)準(zhǔn)化變量。)
將上述表達式,與所對應(yīng)的5個主成分的方差貢獻率做內(nèi)積,得到粗毛淫羊藿質(zhì)量綜合評價函數(shù)X綜合得分的表達式為:
X綜合得分=(30.259X1+25.408X2+18.767X3+8.677X4+5.496X5)÷88.607
根據(jù)以上表達式得到不同產(chǎn)地粗毛淫羊藿得分值及排序,見表4。
計算峰面積比值,每個樣品的非共有峰面積占總峰面積的比值均小于20%,符合指紋圖譜要求。相似度計算結(jié)果,34批樣品不同產(chǎn)地中,有20批與對照圖譜相似度大于0.9,11批與對照圖譜相似度為0.8~0.9,3批與對照圖譜相似度小于0.8,分別為0.606,0.789和0.798,各共有峰的相對保留時間RSD在0.2%~1.49%之間,相對峰面積RSD在17.37%~258.13%之間。貴州大部分產(chǎn)地的粗毛淫羊藿相似度不存在明顯差異,表明不同產(chǎn)地淫羊藿所含化學(xué)成分基本相同,而共有峰峰面積RSD較大,表明不同產(chǎn)地的淫羊藿有效成分含量差別較大。
表4 貴州不同產(chǎn)地粗毛淫羊藿主成分得分、綜合得分與排序
產(chǎn)地編號X1X2X3X4X5X綜合得分排名S3414.955 2-1.3066.5692.513-0.7986.3201S115.208 1-6.2644.9090.6860.1374.5132S264.48610.909-2.226-0.824-2.5873.9483S314.5029.917-1.514-2.8350.0963.7894S274.2187.849-1.444-1.621-2.8753.0485S297.036 31.9610.448-2.7142.3922.9426S286.919 42.4290.299-3.6132.0832.8987S121.0259.451-4.4373.2781.3732.5268S95.3650.985-3.5772.1750.8801.6259S11-1.0835.6390.2392.522-0.0231.54310S55.777-2.6980.9060.230-1.0061.35111S25-6.0058.4434.540-1.411-0.5501.15912S35.958-5.8391.0220.267-0.0900.59713S13-2.5244.535-1.9714.0150.9600.47314S32-4.270-0.6829.2960.9210.8820.46015S22.686-2.796-1.7530.8550.530-0.13916S22-5.3271.6684.306-0.1210.932-0.38317S23-3.2510.4652.961-0.457-0.424-0.42118S18-4.6815.164-2.0980.4981.258-0.43519S41.440-3.464-0.2670.506-0.396-0.53320S80.610-3.361-0.2211.219-0.789-0.73221S30-5.057-1.0172.753-0.4540.606-1.44222S332.524-4.874-3.250-3.6141.134-1.50823S6-5.015-2.5583.468-0.585-0.758-1.81624S21-2.695-1.617-2.5620.6770.323-1.84025S24-12.7161.1536.656-0.439-0.217-2.65926S19-5.227-1.768-2.6190.6790.257-2.76427S17-3.446-2.132-4.473-0.522-0.123-2.79528S20-4.123-4.319-1.4180.484-0.280-2.91729S7-6.975-4.2763.267-0.914-0.615-3.04430S14-1.493-6.692-2.281-0.703-1.064-3.04731S16-3.280-3.325-4.807-0.674-0.060-3.16232S10-0.760-7.061-4.4790.039-0.811-3.27933S15-4.781-4.519-6.239-0.064-0.378-4.27934
聚類分析中S 1和S 24首先被分出來聚為一類,在歐式平方距離為15時,產(chǎn)地S 12,S 18,S 13,S 11,S 31,S 27,S 26聚為一類,其他聚為一類,說明產(chǎn)地S 1和S 34與其他產(chǎn)地有較大區(qū)別。作為貢獻率最大的主成分1的得分排名前2的產(chǎn)地為S 1、S 34,總因子得分分別為15.208和14.955,與其他產(chǎn)地有較大差異,表明主成分分析結(jié)果與聚類分析較一致。
主成分1的信息來自色譜峰2、3、5、6、16號,其中2號共有峰為朝藿定B,3號共有峰為朝藿定C,5號共有峰為淫羊藿苷,6號共有峰和16號共有峰為未知物質(zhì)峰,這5個成分可作為粗毛淫羊藿質(zhì)量評價的指標(biāo)。
綜合得分越高,表明質(zhì)量越好[15-19],綜合得分大于0的產(chǎn)地依次有貴陽市花溪區(qū)高坡鄉(xiāng)(S 34)、貴陽市烏當(dāng)區(qū)水田鎮(zhèn)(S 1)、凱里市金山大道旁(S 26)、安順市普定縣(S 31)、凱里市三棵樹鎮(zhèn)(S 27)、麻江縣谷兵村(S 29)、凱里市麻江縣壩芝鄉(xiāng)(S 28)、貞豐縣珉谷鎮(zhèn)(S 12)、貴陽市修文縣六屯鎮(zhèn)獨山村(S 9)、安龍縣灑雨鎮(zhèn)(S 11)、長順縣營盤鎮(zhèn)(S 5)、江口縣唐古坡(S 25)、貴陽市花溪區(qū)燕樓鄉(xiāng)(S 3)、興義市興仁縣榜榜田(S 13)、安順市西秀區(qū)武當(dāng)路(S 32),初步認(rèn)為這幾個產(chǎn)地的粗毛淫羊藿質(zhì)量較好。綜合得分小于-2.6的產(chǎn)地為印江縣峨嶺鎮(zhèn)普同村(S 24)、畢節(jié)市黔西縣新坪村(S 19)、綏陽縣大路槽鄉(xiāng)園子(S 17)、大方縣大海壩森林公園附近(S 20)、石阡縣聚鳳鄉(xiāng)指甲平村(S 7)、遵義市紅花崗區(qū)袁家寨大橋附近(S 14)、綏陽縣旺草鎮(zhèn)蘿柏小學(xué)附近(S 16)、習(xí)水縣沔山村新村(S 10)、遵義市匯川區(qū)團澤鎮(zhèn)付家灣(S 15)等產(chǎn)地,初步認(rèn)為這幾個產(chǎn)地的粗毛淫羊藿質(zhì)量較差。
由于中藥材受多方面因素的影響,其質(zhì)量存在較大的差異,主成分分析能篩選出共有的特征成分,并指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)決定性作用的化學(xué)成分,但由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜,很多可作為質(zhì)量評價指標(biāo)的成分未知,需進一步研究。運用聚類分析和主成分分析,可實現(xiàn)快速分析,發(fā)揮各自優(yōu)勢,互相驗證和補充,多方面綜合評判粗毛淫羊藿藥材的質(zhì)量。