黃淮稻區(qū)推廣水稻品種稻瘟病抗性基因Pi9和Pi-ta的分子鑒定

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(河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 鄭州 450002)

水稻是全球重要的糧食作物之一，我國50%以上人口以稻米為主食。稻瘟病又稱稻熱病，是由子囊菌引發(fā)的真菌性病害。水稻稻瘟病主要通過氣流傳播，在水稻生長全生育期均可發(fā)病，對水稻生產(chǎn)威脅極大，許多水稻品種因抗病性不佳，常造成嚴(yán)重?fù)p失，甚至絕產(chǎn)。利用抗稻瘟病基因培育抗稻瘟病水稻新品種是最有效的防治稻瘟病手段，也是分子育種的主要方向[1]。現(xiàn)已報(bào)道的抗稻瘟病基因有70多個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)的90多個(gè)主效基因，其中，Pia,Pib,Pik-m,Pik-p,Pita,Piz-t,Pi2,Pi9等24個(gè)基因已被成功克隆[2]。

Pi9是來源于小粒野生稻(Oryzaminuta)的稻瘟病抗性基因，為Piz位點(diǎn)上的復(fù)等位基因。Qu等[3]2006年克隆了該抗稻瘟病基因，該基因位于水稻6號染色體，含有6個(gè)串聯(lián)的NBS-LRR。Pi9 cDNA全長為4 009 bp，含有2個(gè)長度分別為5 362 bp和128 bp的內(nèi)含子；編碼的蛋白產(chǎn)物氨基端含有NBS域，羧基端有17個(gè)不完整的LRR組成的富亮氨酸重復(fù)域。Pi9抗性比較廣，據(jù)研究其對至少21個(gè)稻瘟病菌小種具有抗性，對來自13個(gè)國家的43個(gè)稻瘟病菌株均表現(xiàn)出很高的抗性[4]。分子標(biāo)記輔助選擇育種也發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入Pi9抗性基因能顯著提高水稻的稻瘟病抗性[5-6]。Tian等[7]設(shè)計(jì)了Pi9的特異引物，并對中國434份種質(zhì)材料進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Pi9在中國粳稻材料中普遍存在，但是在秈稻材料中極少被發(fā)現(xiàn)。Pi-ta是來源于秈稻的廣譜稻瘟病抗性基因。Pi-ta基因編碼一個(gè)長度為928個(gè)氨基酸的細(xì)胞質(zhì)膜受體蛋白，該膜受體蛋白含富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRD)和NBS結(jié)構(gòu)域。Pi-ta介導(dǎo)的稻瘟病抗性必須有Ptr(t)的參與，且抗病反應(yīng)是Pi-ta基因編碼產(chǎn)物與稻瘟病菌的無毒基因AVR-Pita表達(dá)產(chǎn)物相互作用引發(fā)的[8-9]?？沟疚敛』騊i-ta與穗頸瘟抗性存在顯著相關(guān)性，少數(shù)江蘇省推廣種植粳稻品種中具有Pi-ta抗性基因[10]。

注：M為DM 2 000；C 1為DX 60；C 2為日本晴；1～60見表1。圖1 Pi9基因PCR檢測

近年來，水稻稻瘟病抗病基因的克隆及分子標(biāo)記的開發(fā)為水稻抗病分子育種提供了良好的機(jī)遇。本研究利用Pi9和Pi-ta基因的分子標(biāo)記，對黃淮稻區(qū)主要種植的60份品種進(jìn)行分子鑒定，明確這2個(gè)主效廣譜抗病基因在品種中的分布狀況，發(fā)掘抗稻瘟病的育種材料，為水稻抗病育種提供抗病親本，對水稻綠色安全生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

黃淮稻區(qū)推廣種植的水稻品種60份，分別為豫粳6號，豫農(nóng)粳6號，原稻108，鄭稻11號，鄭稻18，鄭稻19，鄭稻1號，鄭稻4號，鄭稻5號，鄭粳107，大糧203，菡科18，越富，豫農(nóng)粳12號，豫稻16，旱稻277，旱稻297，旱稻502，洛稻998，新旱2號，鄭旱2號，鄭旱6號，鄭旱9號，鄭旱10號，IRAT 109，丹東陸稻，秦愛，臺東陸稻，紅米，淮稻6號，淮稻8號，淮稻9號，津稻372，連粳10號，連粳11號，南粳42，南粳5055，南粳9108，寧粳3號，寧粳4號，農(nóng)香粳，圣稻16，泰香2號，武香粳14號，武育糯16號，武育糯6號，武運(yùn)粳23，武運(yùn)粳21號，武運(yùn)粳2845，鹽稻11，鹽豐2號，鎮(zhèn)稻88，鎮(zhèn)稻99，白香粳，02428，金農(nóng)絲苗，糯稻，竹單5號，紫香糯，谷梅2號。Pi9的抗病對照材料為DX 60，Pi9的感病對照材料為日本晴，Pi-ta的抗病對照材料為DX 49，Pi-ta的抗病對照材料為新稻18。

1.2 DNA提取和引物

60份水稻品種及對照的種子在10 %的H2O2中浸泡10 min，沖洗3次，放入30 ℃的培養(yǎng)室中黑暗條件催芽，萌發(fā)后在泡沫孔板上播種，3葉期取葉片提取DNA。DNA提取采用改良的SDS方法。Pi9和Pi-ta的PCR特異性引物信息見王生軒等[11]。合成引物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 PCR擴(kuò)增和電泳

PCR擴(kuò)增體系為10.0μL，包括ddH2O 3.0μL、DNA模板1.0μL、10μmol/L引物1.0μL和5.0μL 2×Es Taq MasterMix(由Es Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成，由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供)。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃(Pi9)或56 ℃(Pita)退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。采用添加DNA green的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因PCR產(chǎn)物，紫外燈下觀察，利用凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTM EZ imager，BIO-RAD)進(jìn)行觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pi9基因的標(biāo)記檢測

利用Pi9抗性基因的特異引物對60份黃淮稻區(qū)種植的水稻品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(圖1)。結(jié)果表明，原稻108、鄭稻18、鄭稻19、鄭粳107、大糧203、越富、豫農(nóng)粳12號、豫稻16等31個(gè)品種與抗性對照一樣，擴(kuò)增出1條約480 bp的特異條帶，表明它們均含Pi9抗性基因(表1)；豫粳6號、豫農(nóng)粳6號、鄭稻1號等29個(gè)品種與感病品種一樣，沒有擴(kuò)增出條帶，表明它們不含Pi9基因。攜帶Pi9抗性基因占60份水稻品種的51.67%，說明Pi9已經(jīng)在黃淮稻區(qū)水稻品種中廣泛應(yīng)用。

2.2 Pi-ta基因的標(biāo)記檢測

利用Pi-ta的特異引物對感病對照、抗病對照和60份水稻品種進(jìn)行PCR檢測(圖2)。結(jié)果表明，豫粳6號、豫農(nóng)粳6號、原稻108等51個(gè)品種與感病品種一樣，擴(kuò)增出1條約1 042 bp的特異條帶，表明它們含Pi-ta感病基因序列，為Pi-ta感病材料(圖2 A，表1)。鄭稻18、豫農(nóng)粳12號、豫稻16、南粳5055、農(nóng)香粳、泰香2號、武香粳14號、武運(yùn)粳21號、金農(nóng)絲苗9個(gè)品種與抗性對照一樣，擴(kuò)增出1條約1 042 bp的特異條帶，表明它們均含Pi-ta抗性基因，為Pi-ta抗性材料(圖2 B，表1)。攜帶Pi-ta抗性基因占60份水稻品種的15.00%，說明Pi-ta基因在黃淮稻區(qū)水稻品種中還沒有廣泛應(yīng)用。

注：A為感病基因檢測結(jié)果；B為抗病基因檢測結(jié)果；M為DM 2000；C 1為DX 49；C 2為新稻18；1～60見表1。圖2 Pi-ta抗病基因PCR檢測

表1 Pi9和Pi-ta基因在60個(gè)河南水稻品種中的分布

編號品種 Pi9Pi-ta編號品種 Pi9Pi-ta1豫粳6號--31淮稻8號+-2豫農(nóng)粳6號--32淮稻9號+-3原稻108+-33津稻372+-4鄭稻11號--34連粳10號+-5鄭稻18++35連粳11號+-6鄭稻19+-36南粳42--7鄭稻1號--37南粳5055-+8鄭稻4號--38南粳9108+-9鄭稻5號--39寧粳3號+-10鄭粳107+-40寧粳4號+-11大糧203+-41農(nóng)香粳-+12菡科18--42圣稻16+-13越富+-43泰香2號++14豫農(nóng)粳12號++44武香粳14號++15豫稻16++45武育糯16號--16旱稻277--46武育糯6號--17旱稻297+-47武運(yùn)粳23--18旱稻502--48武運(yùn)粳21號++19洛稻998--49武運(yùn)粳2845+-20新旱2號--50鹽稻11+-21鄭旱2號+-51鹽豐2號+-22鄭旱6號--52鎮(zhèn)稻88+-23鄭旱9號--53鎮(zhèn)稻99+-24鄭旱10號--54白香粳+-25IRAT109--5502428--26丹東陸稻--56金農(nóng)絲苗-+27秦愛--57糯稻--28臺東陸稻--58竹單5號+-29紅米--59紫香糯+-30淮稻6號+-60谷梅2號--

注：“+”表示攜帶抗性基因,“-”表示不攜帶抗性基因。

3 討論與結(jié)論

稻瘟病是水稻三大主要病害之一，近年有逐年高發(fā)趨勢，稻瘟病抗性育種已成為水稻育種家的首要工作[12]。傳統(tǒng)的稻瘟病抗病基因分析，需要稻瘟病生理小種接種鑒定、抗病遺傳分析大量的繁瑣工作。隨著稻瘟病抗病基因的不斷定位、克隆和分子標(biāo)記的開發(fā)，基于對抗病基因DNA序列進(jìn)行標(biāo)記篩選，選擇效率和精準(zhǔn)性均有大幅度提高[13]。已有研究證明，Pi9和Pi-ta基因分子標(biāo)記在輔助選擇育種中的應(yīng)用價(jià)值[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，Pi9和Pi-ta基因在黃淮稻區(qū)主要推廣種植的60個(gè)水稻品種中都有利用，Pi9抗病基因利用較廣泛，51.67%的材料都攜帶Pi9抗病基因；Pi-ta抗病基因利用的較少，只有15.00%的材料攜帶Pi-ta抗性基因。鄭稻18、豫農(nóng)粳12號、豫稻16、泰香2號、武香粳14號和武運(yùn)粳21號共6個(gè)材料同時(shí)攜帶Pi9和Pi-ta2個(gè)稻瘟病抗病基因，占所有材料的10.00 %。顯示黃淮稻區(qū)稻瘟病抗性利用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，尤其是抗病基因的聚合應(yīng)用太少。利用單個(gè)抗稻瘟病基因進(jìn)行抗病育種，單基因抗性品種種植2、3年后抗病性很容易流失，重新成為感病品種。因此，稻瘟病抗病育種要依靠抗性基因的遺傳多樣性，選擇并聚合多個(gè)主效廣譜稻瘟病基因來培育新品種[11]。攜帶Pi9和Pi-ta2個(gè)稻瘟病抗病基因的6個(gè)材料中，武香粳14號、豫稻16、泰香2號和豫農(nóng)粳12號稻瘟病抗性較好，田間具有較高的豐產(chǎn)性，沒有稻瘟病發(fā)病癥狀，是值得育種家利用的優(yōu)良抗性資源。而武運(yùn)粳21號稻瘟病接種鑒定為感穗頸瘟，鄭稻18田間稻瘟病發(fā)病嚴(yán)重，表明稻瘟病抗性機(jī)制復(fù)雜，Pi9和Pi-ta并不能解釋這些品種的稻瘟病抗性，還需要進(jìn)一步的挖掘、鑒定更多的稻瘟病抗性基因，從而為稻瘟病育種利用奠定基礎(chǔ)。