分子標(biāo)記輔助選擇在甜瓜抗病育種研究中的應(yīng)用

張爽爽 王利波 陳 瑩 張金鵬 耿 偉 惠長(zhǎng)敏*

（吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院 長(zhǎng)春 130033）

甜瓜是重要的園藝作物，也是深受人們喜愛的十大水果之一，但是甜瓜在整個(gè)栽培過程中受到多種病害的威脅，其中白粉病、枯萎病、蔓枯病最為嚴(yán)重，已嚴(yán)重影響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，解決甜瓜生產(chǎn)過程中病害問題最有效的途徑就是培育具有綜合抗病性的甜瓜新品種。分子標(biāo)記輔助選擇可以大大縮短育種周期、顯著提高育種效率，已成為甜瓜抗病育種研究中主要的技術(shù)手段[1]。以DNA序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記因重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)已成為分子標(biāo)記輔助選擇的理想標(biāo)記類型[2]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以DNA序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記已廣泛的應(yīng)用在甜瓜抗病育種研究中。本文就分子標(biāo)記輔助選擇在甜瓜抗病育種研究中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，旨在為培育具有綜合抗性的甜瓜新品種提供參考。

1 分子標(biāo)記輔助選擇概述

分子標(biāo)記輔助選擇（markerassistantselection，MAS）是指在基因克隆或定位的基礎(chǔ)上，通過分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，在群體中對(duì)含有目標(biāo)性狀的個(gè)體進(jìn)行選擇[1、3]。MAS可以在植株早期對(duì)含有目標(biāo)性狀的個(gè)體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的選擇，而且不受外界環(huán)境的影響，在一定程度上解決育種過程中存在盲目性、效率低的問題，大大加快了育種進(jìn)程。

選擇合適的分子標(biāo)記是MAS在實(shí)際應(yīng)用中的首要工作。分子標(biāo)記的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段：第一代是以傳統(tǒng)的分子雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如RFLP、VNTR；第二代以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如RAPD、SSR、AFLP；第三代是以基因組序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如SNP、InDel[2、4]。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展以及高通量測(cè)序成本的降低，以基因組序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記應(yīng)用的越來越多。應(yīng)用于MAS的分子標(biāo)記需要與目標(biāo)性狀位點(diǎn)緊密連鎖或者存在共分離現(xiàn)象，才能準(zhǔn)確地對(duì)個(gè)體進(jìn)行選擇。簡(jiǎn)而言之，選擇有效的分子標(biāo)記才能快速、精確地在基因組水平對(duì)個(gè)體進(jìn)行選擇，達(dá)到輔助傳統(tǒng)育種方法的目的，高效地進(jìn)行育種工作。

2 分子標(biāo)記輔助選擇在甜瓜抗病育種中的應(yīng)用

2.1 分子標(biāo)記輔助選擇在甜瓜抗白粉病育種中的應(yīng)用

白粉病是危害甜瓜生產(chǎn)的一種世界性病害，在甜瓜整個(gè)生育期內(nèi)均可發(fā)生。白粉病主要危害甜瓜葉片，導(dǎo)致植株光合能力下降，引起植株早衰甚至死亡，已成為影響甜瓜生產(chǎn)中的主要障礙[5]。引起甜瓜白粉病的主要病原菌是單囊殼白粉菌（Podosphaeraxanthii）和二孢白粉菌（Golovinomycescichoracearum），其中單囊殼白粉菌（P.xanthii）起主導(dǎo)作用，甜瓜白粉病菌生理小種多、分化快，給白粉病的防治工作帶來一定的困難[6]。因此開展白粉病抗性基因的研究及培育抗白粉病品種是解決甜瓜白粉病的重要突破口。

張海英等研究發(fā)現(xiàn)甜瓜材料K7-1對(duì)P.xanthii2F的抗性是由顯性單基因Pm-2F控制，并篩選到與Pm-2F緊密連鎖的兩個(gè)SSR標(biāo)記，但是這兩個(gè)標(biāo)記在輔助甜瓜抗白粉病育種的應(yīng)用中還有局限性[7]。許勇團(tuán)隊(duì)在之前的科研基礎(chǔ)上開發(fā)出與Pm-2F更緊密的CAPS/InDel分子標(biāo)記[8、9]。研究結(jié)果表明，CAPS-HphⅠ、CAPS-DdeⅠ、InDel02與抗白粉病基因Pm-2F呈緊密連鎖，連鎖距離分別為0.26cM、0.35cM、0.12cM；InDel01與抗白粉病基因Pm-2F呈現(xiàn)共分離。在120份甜瓜種植資源中驗(yàn)證這四個(gè)標(biāo)記的準(zhǔn)確性，CAPS-HphⅠ、CAPS-DdeⅠ、InDel02標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間符合率分別為93.3%、91.6%、97.5%，InDel01標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間符合率為100%。驗(yàn)證結(jié)果表明上述分子標(biāo)記可有效地運(yùn)用在篩選抗白粉病種質(zhì)資源研究中。

李冰等以抗病甜瓜自交系MR-1為母本，感病自交系Top Mark為父本，構(gòu)建了含有346份材料的F2代群體。利用BSA法（BulkedSegregationAnalysis） 及 NGS技術(shù)（Next-Generation Sequencing）對(duì)MR-1中白粉病基因進(jìn)行研究[10]。結(jié)果在甜瓜12號(hào)染色體上獲得了與抗白粉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記BSA12-LI3ECORI和BSA12-LI4HINFI，連鎖距離分別為0.02cM和0.28cM。趙玉龍利用BSA12-LI4HINFI標(biāo)記對(duì)355株自然群體及76株雙親群體進(jìn)行抗白粉病的篩選，結(jié)果BSA12-LI4HINFI標(biāo)記在驗(yàn)證自然群體材料的田間符合率為96.3%，驗(yàn)證雙親群體材料的田間符合率為100%；研究結(jié)果表明BSA12-LI4HINFI標(biāo)記能夠準(zhǔn)確地判斷植株是否抗病，可以應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

Fernando J等以含有TGR-1551基因型的抗病材料和西班牙地方品種感病的“BoladeOro”為研究對(duì)象，構(gòu)建了含有159份材料的F2代群體。利用BSA法識(shí)別到8個(gè)與抗病相關(guān)的AFLP標(biāo)記，通過對(duì)AFLP片段的克隆及序列分析，得到了6個(gè)以PCR為基礎(chǔ)的共顯性標(biāo)記[11]。其中PM4-dCAPS標(biāo)記可以擴(kuò)增出一段109bp的序列，在這段序列上存在三個(gè)SNP位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ進(jìn)行酶切，可將感病植株的序列切成86bp和23bp兩段，而抗病植株的序列則不被切斷。林琳利用PM4-dCAPS標(biāo)記對(duì)17個(gè)材料的白粉病抗性進(jìn)行鑒定，得到了13份對(duì)白粉病有抗性的材料[12]。

2.2 分子標(biāo)記在甜瓜抗枯萎病育種中的應(yīng)用

甜瓜枯萎病是由甜瓜專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）引起的一種土傳性病害[13]?？菸〉湫桶Y狀是萎蔫；發(fā)病初期，植株葉片從基部向頂部逐漸發(fā)生缺水狀萎蔫，中午明顯，早晚可恢復(fù)；發(fā)病嚴(yán)重后植株葉片全部萎蔫，不再恢復(fù)直至枯死[14]。甜瓜?；图怄哏牭毒兴膫€(gè)生理小種，分別為race0，race1，race2，race1、2。已報(bào)道的甜瓜抗尖孢鐮刀菌的基因有3 個(gè)，分別為 Fom-1（抗 race0 和 2，但感 race1，race1、2）、Fom-2（抗 race0 和 1，但感 race2，race1、2）、Fom-3（抗 race0，1 和 2，但感race1、2），目前唯一克隆出來的是 Fom-2[15、16]。

王士偉以高抗枯萎病的美國(guó)甜瓜和高感枯萎病的仙果027-5厚皮甜瓜為試驗(yàn)材料，克隆了Fom-2基因的LRR區(qū)核苷酸序列，通過軟件分析在抗病植株和感病植株的序列之間存在3個(gè)SNP位點(diǎn)，將SNP位點(diǎn)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成功能性分子標(biāo)記。利用限制性內(nèi)切酶酶切和等位基因特異性PCR兩種方法，在高抗和高感枯萎病材料的F1和F2代群體中驗(yàn)證SNP位點(diǎn)的有效性和可靠性，結(jié)果表明Fom-2 LRR區(qū)SNP位點(diǎn)2和3處可以轉(zhuǎn)化為枯萎病抗性相關(guān)的功能性分子標(biāo)記[17]。林琳用Fom-2LRR區(qū)標(biāo)記鑒定17份材料對(duì)枯萎病生理小種0和1的抗性，結(jié)果篩選到1份純合抗性材料，1份沒有抗性材料，15份雜合抗性材料[12]。

趙玉龍以MR-1和WI998為試驗(yàn)材料，根據(jù)對(duì)兩親本的重測(cè)序結(jié)果，針對(duì)Fom-2蛋白的SCOP結(jié)構(gòu)功能域（富含LRR的結(jié)構(gòu)功能域）的核苷酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)CAPS引物，開發(fā)與Fom-2緊密連鎖的CAPS分子標(biāo)記[15]。在開發(fā)出的7對(duì)引物中有1對(duì)可以準(zhǔn)確鑒定植株對(duì)枯萎病的抗性。利用355個(gè)自然群體及76個(gè)F2代群體對(duì)該引物的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果在自然群體中分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間符合率為94.8%，在親本群體中分子鑒定結(jié)果的田間符合率為100%。說明該引物能夠精確地判斷植株是否感病，可以應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

AIL等以對(duì)Fom-1有抗性的“Charentais-Fom1”和無抗性的“TGR-1551”為試驗(yàn)材料，構(gòu)建F2代群體，在400對(duì)RAPD引物中篩選到3對(duì)在抗病、感病植株間存在差異的引物，通過PCR對(duì)片段進(jìn)行克隆并分析差異序列的堿基，開發(fā)出與Fom-1基因連鎖的SCAR標(biāo)記[18]。通過在群體材料中驗(yàn)證，得到了能鑒定感或抗生理小種0和2的分子標(biāo)記SV01574。林琳用SV01574標(biāo)記鑒定17份材料對(duì)枯萎病生理小種0和2的抗性，結(jié)果篩選到14份對(duì)生理小種0和2有抗性材料[12]。

2.3 分子標(biāo)記在甜瓜抗蔓枯病育種中的應(yīng)用

甜瓜蔓枯病是一種世界性土傳病害，也是危害我國(guó)甜瓜生產(chǎn)的主要病害。在甜瓜伸蔓到坐果期間易發(fā)病，田間發(fā)病率可達(dá)30%以上。蔓枯病主要危害植株莖蔓和葉片；莖部多在莖基部和節(jié)部發(fā)病，破壞植株莖部皮層組織使整個(gè)植株逐漸干枯收縮、表皮龜裂和剝落，最終導(dǎo)致植株死亡[19]。對(duì)甜瓜蔓枯病抗性資源研究最早是PI140471材料，其抗性由單個(gè)顯性基因Gsb-1提供，之后的一些抗病品種的抗性大多來源于此材料。2004年美國(guó)康奈爾大學(xué)篩選到五種抗性資源，分別為PI482398（單個(gè)顯性基因Gsb-4控制其抗性）、PI482398（由單個(gè)顯性基因 Gsb-4控制其抗性）、PI157082（由單個(gè)顯性基因Gsb-2控制其抗性）、PI511890（由單個(gè)顯性基因Gsb-3控制其抗性）和PI140471（由單個(gè)顯性基因Gsb-1控制其抗性）[20]。目前已開發(fā)出多個(gè)與上述資源抗性基因連鎖的分子標(biāo)記并已應(yīng)用在抗蔓枯病的育種研究中。

張永兵（2007）以抗蔓枯病的材料PI1482398及感病的甜瓜自交系白皮脆為親本，建立了抗、感F2代群體，利用BSA法篩選64對(duì)AFLP引物，其中一對(duì)引物在抗、感基因池中擴(kuò)增出一條分子量為285bp的特異條帶，經(jīng)雙親、F1及F2代抗、感單株驗(yàn)證，該特異條帶在抗性單株中出現(xiàn)[21]。張永兵（2011）以抗蔓枯病種質(zhì)資源PI157082與感病的甜瓜自交系白皮脆為親本，建立了含有134份材料的抗、感F2代群體，利用BSA法篩選72條ISSR引物。其中共有3條引物在F2代抗、感基因池中擴(kuò)增出多態(tài)性片段，用雙親、F1和F2代抗、感單株對(duì)這3條引物進(jìn)一步驗(yàn)證，其中引物ISSR-57擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶與抗性基因Gsb-2表現(xiàn)連鎖關(guān)系，遺傳距離為11.3cM，定名為ISSR-57560。ISSR-PCR擴(kuò)增體系穩(wěn)定、重復(fù)性好，ISSR-57560可以作為甜瓜抗蔓枯病輔助選擇的備選分子標(biāo)記[22]。

王紅英等以抗蔓枯病自交系PI482398（含抗蔓枯病基因Gsb-4）和感病自交系白皮脆為試驗(yàn)材料，構(gòu)建F2代群體，利用BSA法對(duì)89對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，其中引物CMTA170a在抗性材料中可擴(kuò)增出約為120bp的條帶。利用軟件對(duì)該標(biāo)記與抗性基因Gsb-4之間的遺傳關(guān)系進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果表明：該標(biāo)記與抗性基因Gsb-4存在連鎖關(guān)系，遺傳距離為5.14cM[23]。

姜陸以抗蔓枯病甜瓜品種IranH和以感蔓枯病甜瓜品種Hami413為試驗(yàn)材料，構(gòu)建128株F2代分離群體，利用法BSA法篩選出甜瓜抗病池與感病池中擴(kuò)增出差異條帶的10對(duì)SSR分子標(biāo)記引物[24]。通過對(duì)分離群體中的單株進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)分離群體中蔓枯病抗、感的情況，篩選與分離后代中抗、感情況較為吻合的候選分子標(biāo)記2個(gè)為后續(xù)抗性甜瓜材料中抗性基因的定位奠定基礎(chǔ)。

3 總結(jié)

目前對(duì)甜瓜生產(chǎn)過程中發(fā)生的白粉病、枯萎病及蔓枯病并沒有完全有效的防治措施，甜瓜一旦被白粉病、枯萎病及蔓枯病病菌侵染，被治愈的可能性很小。解決甜瓜生產(chǎn)過程中病害問題最經(jīng)濟(jì)、有效的途徑就是培育具有綜合抗性的甜瓜品種，減少病菌對(duì)甜瓜的侵染。前文綜述了近年來報(bào)道的與甜瓜白粉病、枯萎病及蔓枯病相關(guān)的分子標(biāo)記，為利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)培育具有綜合抗性的甜瓜新品種提供參考。隨著測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展及測(cè)序成本進(jìn)一步降低，國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息將越來越豐富，分子標(biāo)記開發(fā)的可利用資源逐步增加，為開展甜瓜基因組水平上的研究提供了前所未有的機(jī)遇。今后在甜瓜的抗病育種研究中，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將具有及其廣闊的應(yīng)用前景和利用價(jià)值。