擬南芥絲氨酸羧肽酶KL58分析

李翠 郝福順 王曉陽 孫立榮

摘 要：植物絲氨酸羧肽酶（SCP）以及絲氨酸羧肽酶類蛋白（SCPL），具有參與催化蛋白水解反應(yīng)、傷應(yīng)答反應(yīng)，合成芥子?；O果酸和油菜素內(nèi)酯的作用。然而，這類蛋白是否調(diào)節(jié)植物應(yīng)答其它逆境脅迫反應(yīng)還不清楚。我們課題組以擬南芥T-DNA插入突變體庫篩選獲得一株對(duì)低鉀反應(yīng)敏感的突變體，命名為kl58（K+ lower mutant 58）。KL58屬于SCP類蛋白家族，我們采用一些生物學(xué)基本技術(shù)，對(duì)該突變體進(jìn)行了一些基本分析，以期為該方向的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：絲氨酸羧肽酶；KL58；Tail-PCR

絲氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidases， SCP）是一類主要大量而廣泛地存在于高等植物或真菌和動(dòng)物組織中的真核生物細(xì)胞蛋白水解酶類。它參與多肽和蛋白質(zhì)的加工、修飾與降解等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要涉及如種子萌發(fā)過程中貯藏蛋白的水解、細(xì)胞程序性死亡中胞內(nèi)組分自溶、創(chuàng)傷反應(yīng)、抗逆等多個(gè)生理過程。目前，通過Northern雜交技術(shù)，RT-PCR技術(shù)分析和原位雜交技術(shù)等方法，從大麥、小麥、擬南芥等植物中分離到了SCP及SCP類蛋白（SCPL）的基因及它們編碼的蛋白質(zhì)。研究人員發(fā)現(xiàn)水稻的SCPL家族中的OsBISCPL1基因，它主要在根部、葉片和葉鞘等部位中表達(dá)量比較高，在莖部表達(dá)量相對(duì)較低。另外還發(fā)現(xiàn)，OsBISCPL1過表達(dá)植株表現(xiàn)出對(duì)氧化脅迫的耐受性增加和相關(guān)的氧化脅迫基因表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)OsBISCPL1基因可能參與植物體對(duì)防御病原體感染的反應(yīng)和抵抗氧化脅迫的調(diào)節(jié)。從煙草中分離得到的胞外型絲氨酸羧肽酶Ⅲ型基因NtSCP1和NtSCP2，在各個(gè)組織中都均有不同程度的表達(dá)，體外純化的His 標(biāo)簽NtSCP1蛋白具有羧肽酶活性。

先前已經(jīng)對(duì)SCP和SCPL編碼基因的部分進(jìn)行了研究，但針對(duì)某一類基因或某些基因的功能還鮮有人報(bào)道。

一、主要實(shí)驗(yàn)方法

1.β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色：將GUS染液加入離心管中，放入材料，避光，37℃染色2-4 h，依次用50%、75%、100%的乙醇脫色10 min。

2.擬南芥根細(xì)胞的質(zhì)壁分離：將生長(zhǎng)7 d的轉(zhuǎn)基因植株幼苗根浸泡在0.8 M甘露醇溶液中10-15 min，結(jié)束后用顯微鏡觀察。

3.DAPI染色：將生長(zhǎng)7-8 d的轉(zhuǎn)基因幼苗浸泡到DAPI染液中，染色15-20 min后，用蒸餾水清洗3-4次，顯微鏡下觀察。

二、結(jié)果與分析

1.擬南芥KL58基因的獲得：在MS培養(yǎng)基上，該突變體與WT長(zhǎng)勢(shì)和株型上沒有明顯差異，然而在含400M K+的培養(yǎng)基上，WT和kl58的生長(zhǎng)都受到了不同程度的抑制，突變體植株矮小，側(cè)根減少，葉片萎蔫。與WT相比，kl58對(duì)低鉀脅迫更敏感（如圖2-1 A-2）。通過Tail-PCR技術(shù)確定導(dǎo)致kl58缺失的基因，如圖2-1 B 所示，從左向右的電泳泳道分別是第四輪、第三輪、第二輪、第一輪。把第四輪的目的條帶切膠回收，測(cè)序結(jié)果顯示，T-DNA反向插入在AT2G22920終止密碼子最后一個(gè)堿基前第四個(gè)堿基處，AT2G22920為絲氨酸羧肽酶基因SCP12。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)kl58中KL58沒有表達(dá)，而WT中能夠正常擴(kuò)增出KL58的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（圖2-1 C），說明kl58為基因完全缺失突變體。

2.KL58基因主要在幼苗根部表達(dá)：為了確定KL58的組織化學(xué)定位，構(gòu)建了KL58pro：：GUS轉(zhuǎn)基因材料（圖2-2 A、B）。利用GUS染液染色，圖2-2 C顯示出了KL58在轉(zhuǎn)基因植株種子、幼苗、成苗、花、果莢中的組織表達(dá)情況，從圖中看出，KL58在種子中沒有表達(dá)；在3天幼苗的根部表達(dá)量最高，并且除去根尖外，其余根部都有大量表達(dá)，包括根的中柱和根毛；在3天的幼苗下胚軸和葉子中都沒有表達(dá)。在生長(zhǎng)5天的KL58pr：：GUS植株中，同樣是根部表達(dá)量也非常高，幾乎整個(gè)根部都有表達(dá)，少量根尖除外；與生長(zhǎng)3天不同的是5天幼苗下胚軸的基部有大量表達(dá)，在葉子中沒有表達(dá)。生長(zhǎng)7天的幼苗根部表達(dá)量也非常高，下胚軸的基部有少量表達(dá)，葉子中沒有表達(dá)。而在第7天以后，根部的表達(dá)量較弱，11天個(gè)別葉子中有少量表達(dá)，下胚軸基部和根部銜接的部位表達(dá)量很高，在根部的其它部位，沒有觀察到有KL58的表達(dá)。在生長(zhǎng)14天的幼苗中，植株的整個(gè)根部只能看到個(gè)別主根部位和側(cè)根部位有表達(dá)，下胚軸基部有少量表達(dá)，葉子中有少量表達(dá)。而在生長(zhǎng)了21天的成苗中，只有個(gè)別根和葉子有少量表達(dá)。在花序結(jié)構(gòu)中，花萼部分看到有少量表達(dá)，在花的其它結(jié)構(gòu)如花藥、花絲、柱頭、花柱、子房等中都沒有觀察到表達(dá)，并且在花托部位也沒有觀察到表達(dá)。在果莢中也沒有觀察到KL58的表達(dá)。綜上所得，KL58在生長(zhǎng)3-7天的幼苗根部表達(dá)量最高。

3.KL58亞細(xì)胞定位分析：為了觀察KL58基因亞細(xì)胞定位情況，構(gòu)建了永久表達(dá)35S：：pEGAD：：KL58-GFP材料（圖2-3 A）。

將35S：：pEGAD：：KL58-GFP穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子點(diǎn)在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將生長(zhǎng)7 d左右的幼苗在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行GFP熒光掃描觀察。結(jié)果在幼苗根部檢測(cè)到了GFP綠色熒光（圖2-3 A）。從圖中我們可以看到，綠色熒光主要分布在細(xì)胞的周圍，也就是在細(xì)胞壁或者是細(xì)胞膜的部位，另外，還可以看到在個(gè)別細(xì)胞的內(nèi)部也有顏色很亮的熒光，這個(gè)部位可能是細(xì)胞核。那么為了確定KL58是定位在細(xì)胞壁還是細(xì)胞膜，于是設(shè)計(jì)的質(zhì)壁分離實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GFP熒光出現(xiàn)在根細(xì)胞質(zhì)膜部位（圖2-3 B），而在細(xì)胞壁處沒有發(fā)現(xiàn)熒光。為了確定KL58是否在細(xì)胞核中存在，設(shè)計(jì)了DAPI染色實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞中的細(xì)胞核能夠被DAPI染成藍(lán)色。圖2-3 C所示，染DAPI的視野，顏色比較深的即為細(xì)胞核，綠色熒光視野中顏色深的部分與DAPI染色深的部分不重疊，說明KL58沒有定位在細(xì)胞核中。

4.KL58在細(xì)菌中誘導(dǎo)表達(dá)及Western-Blot檢測(cè)：為了測(cè)定KL58是否具有絲氨酸羧肽酶活性，我們構(gòu)建原核表達(dá)載體，在體外表達(dá)出蛋白。圖2-4A是載體構(gòu)建后的驗(yàn)證電泳圖。

為了在體外誘導(dǎo)表達(dá)出KL58蛋白，將上述所得到的重組KL58-pET-28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，即將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入蛋白表達(dá)菌株。搖菌，用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示（圖2-4B 左），經(jīng)0.3 mM IPTG誘導(dǎo)后，未誘導(dǎo)的菌液中沒有表達(dá)蛋白，誘導(dǎo)后全細(xì)菌裂解液含較多分子量大小與目的蛋白一致的條帶，即很可能為目的蛋白，而細(xì)菌裂解液經(jīng)離心后的上清液中目的條帶的量較少，收集大量菌后才能為后續(xù)酶活性測(cè)定純化到到大量蛋白。為了驗(yàn)證誘導(dǎo)出來的蛋白確實(shí)為帶His標(biāo)簽的目的蛋白，于是做了Western-Blot檢測(cè)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)大量表達(dá)出來的目的條帶確實(shí)為His標(biāo)簽融合蛋白（圖2-4B）。

三、結(jié)語

RT-PCR分析證明，KL58在kl58中沒有表達(dá)。然而后期多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，kl58在低鉀脅迫下的表型不穩(wěn)定。為揭示KL58的功能，研究了kl58在高鐵、高鋅、低鋅等脅迫下的表型，結(jié)果顯示，在這些脅迫下突變體與WT在生長(zhǎng)和發(fā)育方面沒有顯著差別。構(gòu)建了KL58pro：：GUS 載體，同時(shí)獲得了陽性GUS轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)植株生長(zhǎng)時(shí)期的各個(gè)部位進(jìn)行組織化學(xué)染色，觀察到KL58在幼苗的根部表達(dá)較高，在幼苗期的葉子中表達(dá)較低，在種子、果莢及花序結(jié)構(gòu)中沒有表達(dá)。構(gòu)建了KL58基因融合綠色熒光蛋白（GFP）基因載體，研究KL58的亞細(xì)胞定位情況，證明KL58定位在細(xì)胞膜上。為確定 KL58是否具有絲氨酸羧肽酶活性，構(gòu)建了KL58-pET-28a原核表達(dá)載體，并且成功在細(xì)菌中誘導(dǎo)表達(dá)出了該蛋白，為測(cè)定其絲氨酸羧肽酶活性奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 梅傳生， 張遠(yuǎn)海， 吳光南. 水稻葉片衰老過程中氨肽酶活性的變化[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 1987， 13： 58-63.

[2] Skidgel RA， Erdos EG. Cellurar carboxypeptidases[J]. Immunological Reviews， 1998， 161： 129-141.

[3] Hao CM， Huang FL. Cloning and expression of carp cathepsin Z： possible involvement in yolk metabolism[J]. Comparative Biochemistry and Physiology B： Biochemistry and Molecular Biology， 2008， 149： 541-551.

[4] 馮英， 劉慶坡， 賈佳， 等. 擬南芥絲氨酸羧肽酶類蛋白家族的基因組學(xué)分析[J]. 遺傳學(xué)報(bào)， 2005， 32： 864-873.

[5] 王育華， 鄒杰， 陳信波. 植物絲氨酸羧肽酶及其類蛋白的研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)雜志， 2010， 27： 1-5.

[6] Liu HZ， Wang X， Zhang HJ， et al. A rice serine carboxypeptidase-like gene OsBISCPL1 is involved in regulation of defense responses against biotic and oxidative stress[J]. Gene， 2008， 420： 57-65.

[7] Manuela DB， Melanie D， Catherine N， et al. NtSCP1 from tobacco is an extracellular serine carboxypeptidase III that has an impact on cell elongation[J]. Plant Physiology， 2012， 158： 1220-1229.

作者簡(jiǎn)介： 李翠（1987-），女，漢族，河南中牟人，現(xiàn)供職單位：鄭州電子信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ，學(xué)位：理學(xué)碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)。

通訊作者簡(jiǎn)介：孫立榮（1968-），女，漢族，籍貫：山東省煙臺(tái)市萊山區(qū)高新區(qū)，供職單位：河南大學(xué)，職稱：副教授，學(xué)位：理學(xué)博士，研究方向：植物逆境生物學(xué)。

基金項(xiàng)目：河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（15A210018）和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070239）。