水與食品中諾如病毒檢測技術(shù)研究

梁錦填 黎小鵬 姚德祥 陳杰良 陳楠 高文彬 周嘉誠 馬世柱

摘要 采用Trizol法、硅膠柱法、磁珠法分別提取病毒核酸，通過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測比較效果，選擇最優(yōu)提取方法；采用MCE-PEG富集法（混合硝酸纖維素膜第1次富集和聚乙二醇沉淀第2次富集）對水中諾如病毒進(jìn)行富集；對生蠔腸腺、鰓組織進(jìn)行前處理后，用磁珠法提取病毒核酸，通過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。結(jié)果表明，硅膠柱法提取核酸效果較好；MCE-PEG法富集水中諾如病毒有效；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)能檢測出染毒貝類中的諾如病毒。

關(guān)鍵詞 諾如病毒；核酸提??；MCE-PEG富集法；實(shí)時(shí)熒光PCR

中圖分類號 TS207.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）17-0239-03

Abstract The virus nucleic acid was extracted by the Trizol method，the silica gel column method and the magnetic bead method.The comparison effect was detected by real-time fluorescent PCR，and the optimal extraction method was selected.The MCE-PEG enrichment method（first enrichment of mixed nitrocellulose membrane and second enrichment of polyethylene glycol precipitation）was adopted.After pretreatment of the gut and gill tissue，the viral nucleic acid was extracted by magnetic bead method and detected by real-time fluorescent PCR.The results showed that the silica gel column method was better for extracting nucleic acids；the MCE-PEG method was effective for enriching Norovirus in water；real-time fluorescent PCR technology could detect Norovirus in infected shellfish.

Key words Norovirus；nucleic acid extraction；MCE-PEG enrichment method；real-time fluorescent PCR

長期以來，食源性疾病頻發(fā)，嚴(yán)重影響人類健康。研究發(fā)現(xiàn)，病毒在食源性疾病的傳播中也占有重要地位[1]。諾如病毒（Norovirus，NVs）屬于脊椎動(dòng)物病毒（Vertebrate Virus）杯狀病毒（Caliciviridae），是非細(xì)菌性急性病毒性腸胃炎暴發(fā)的主要原因，是引起兒童和成人散發(fā)性急性腸胃炎的主要因素，常在餐館、醫(yī)院、學(xué)校、家庭及其他人群中暴發(fā)。諾如病毒為球形，呈20面體對稱。從胃腸炎患者糞便中提取的NVs的cDNA全序列分析表明，NVs基因組為7.5～8.0單股正鏈RNA病毒[2]。其基因組包括3個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frames，ORFs），分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白、衣殼蛋白和一種功能還不清楚的蛋白[3]。

NVs傳染發(fā)生幾率高（>50%），且少量（10～100個(gè)）的病毒粒子即可引發(fā)感染[4]。NVs在離體條件下的存活力很強(qiáng)，主要通過被污染的食物進(jìn)行傳播，該類病毒通過糞—口途徑進(jìn)行傳播；此外，接觸食物、表面、手、水都是傳播的重要途徑。美國CDC數(shù)據(jù)顯示，12%的NVs是人與人之間的傳播，39%的NVs暴發(fā)是由蔬菜、色拉、雙殼貝類、禽類等食源性載體傳播的。世界上最常見的基因型是GGⅡ/4型NVs，我國病人感染的NVs也是以基因組GGⅡ/4型為主[5]。

本文通過比較Trizol法、硅膠柱法及磁珠法提取核酸的效率，選擇最簡單易行且提取效果好的方法進(jìn)行核酸提??；采用MCE-PEG富集法對水中諾如病毒進(jìn)行富集；取生蠔腸腺、鰓組織進(jìn)行人工染毒，前處理的貝類經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。PCR方法檢測技術(shù)具有直觀、敏感性高、重復(fù)性好、可定量、速度快、操作簡便、污染少、實(shí)時(shí)定量等諸多優(yōu)點(diǎn)，可以為食品以及水中的諾如病毒檢測提供科學(xué)參考，進(jìn)而確保人類飲食安全。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑及試劑盒。試劑：氯仿、純凈水（經(jīng)高壓消毒）、2.5 mol/L MgCl2、1 mol/L鹽酸、飽和NaOH溶液、含3%牛肉膏及0.05 mol/L甘氨酸的混合液（pH值9.5）、40%PEG-6000、5 mol/L NaCl溶液、甘氨酸（0.05 mol/L）-NaCl（0.15 mol/L，pH值9.5）、氯仿-丁醇（1∶1）。

試劑盒：核酸檢測試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，貨號DR-0045-02）、QIAamp？誖MinElute？誖Virus Spin Kit（貨號57704）、Maxwell？誖16 Viral Total Nucleic Acid Purif-ication Kit試劑（美國Promega公司，貨號021165）。

1.1.2 試驗(yàn)儀器。KS130圓周振蕩器（德國IKA公司）、Megafuge 11R高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo SCIENTIFIC公司）、K20B干式恒溫器（中國廣州正一科技有限公司）、生物安全柜、Maxwell AS200-LX核酸提取儀（美國Promega公司）、MS3 digital 微型渦旋振蕩器（德國IKA公司）、CFD-3220 Opticon 2實(shí)時(shí)熒光定量檢測儀（美國Opticon公司）、0.45 μm混合硝酸纖維素膜（Sartorious公司，貨號11406-47-ACN）、真空抽濾器、FE20酸度計(jì)。

1.1.3 糞便標(biāo)本。糞便樣本L、M為中山市某醫(yī)院疑似諾如病毒感染病例，經(jīng)過PCR檢測及測序確認(rèn)為諾如病毒后，在12 mL病毒保存液中加入500 μL糞便，振蕩10 min，在3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液放置于-70 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 食品樣本。貝類（生蠔），購自中山市東區(qū)庫充市場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核酸提取方法。第1種方法是Trizol法，步驟如下：①取液態(tài)樣本各200 μL，放置于1.5 mL滅菌離心管，加入Trizol試劑400 μL、氯仿200 μL，振蕩20 s后靜置3 min，再在12 000 r/min條件下離心2 min；②取無色上層液體，注意不觸及中間絮狀層，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，然后加入RNA提取液A 10 μL，再充分混勻，在8 000 r/min條件下離心1 min后，棄去所有液體；③加入無水乙醇400 μL，充分振蕩混勻，在8 000 r/min條件下離心1 min，將液體去除干凈，此過程中避免觸及沉淀顆粒；④將裝有沉淀的離心管擺放在通風(fēng)櫥中風(fēng)干15 min，然后加入DEPC H2O 30 μL，吸取混勻管中沉淀，得到白色懸濁液，直接用于檢測。

第2種方法是硅膠柱法，步驟如下：①在200 μL糞便處理液中加入25 μL QIAGEN 蛋白酶及200 μL AL緩沖液（含有28 μg/mL的Carrier RNA），56 ℃孵育15 min后加入250 μL無水乙醇，充分混勻，短暫離心；②將步驟①所得的液體全部加入到QIAamp MinElute柱中，在8 000 r/min條件下離心1 min，加入500 μL AW1液，在8 000 r/min條件下離心1 min，棄去廢液，再加入500 μL AW2液，在8 000 r/min條件下離心1 min，棄去廢液，再加入500 μL無水乙醇，在8 000 r/min條件下離心1 min，棄去廢液，再在14 000 r/min條件下離心2 min，最后加入50 μL DEPC 水，在8 000 r/min條件下離心1 min洗脫。

第3種方法是磁珠法，按Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification Kit試劑盒說明書提取。

1.2.2 MCE-PEG富集法。第一步是纖維素膜第1次富集病毒，即向1 L純凈水中加入含有諾如病毒的糞便懸液原液1 mL，水樣中加入2.5 mol/L MgCl2 20 mL，使其終濃度達(dá)到0.05 mol/L；用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)水樣使pH值=3.0；采用真空抽濾使之通過0.45 μm混合硝酸纖維素膜，剪碎混合硝酸纖維素膜，放入50 mL離心管中，并加入玻璃珠和20 mL含3%牛肉膏及0.05 mol/L甘氨酸的混合液（pH值9.5），在圓周振蕩器上振蕩30 min，洗脫濾膜[6]。

第二步是沉淀第2次富集病毒，即向含有病毒的洗脫液中加入40%PEG-6000，使終濃度為10%；加入5 mol/L NaCl溶液，使終濃度為0.3 mol/L；充分混勻，于4 ℃下靜置過夜；在4 ℃、10 000 r/min條件下離心30 min后棄上清液，保留沉淀用500 μL純凈水重懸，待提取病毒RNA[7]。

1.2.3 貝類中諾如病毒的檢測方法。取生蠔腸腺組織及蠔腮，剪碎攪拌成均質(zhì)狀，稱重每份10 g分裝。分為陽性腸腺組織、陰性腸腺組織對照、陽性蠔腮和陰性蠔腮對照4組，另設(shè)1個(gè)病毒液組。每組加入500 mL諾如病毒陽性糞便上清，水平搖床30 min，充分混勻。加入20 mL甘氨酸（0.05 mol/L）-NaCl（0.15 mol/L，pH值9.5），劇烈漩渦振蕩5 min，在5 000 r/min條件下離心10 min，吸上清按1∶1的比例加入氯仿-丁醇（1∶1），漩渦振蕩5 min，然后在5 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清（注意在冰上操作）。上清調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.5，加入40%PEG-6000，使終濃度為10%；加入5 mol/L NaCl，使終濃度為0.3 mol/L。充分漩渦混勻，置于4 ℃冰箱沉淀過夜。然后在10 000 r/min條件下離心30 min。棄上清，沉淀用1 mL DEPC水重懸。重懸液中按1∶1的比例加入氯仿-丁醇（1∶1）；劇烈振蕩5 min，在5 000 r/min條件下離心5 min，取上清待提取RNA[8]。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：NV GⅡ型核酸熒光檢測混合液19 μL 、RT-PCR酶1 μL、RNA 5 μL。

PCR的反應(yīng)條件：45 ℃ 10 min逆轉(zhuǎn)錄；95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火60 s，45個(gè)循環(huán)。于60 ℃ 60 s退火階段采集熒光信號。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種核酸提取方法的比較

M樣和L樣為2個(gè)含諾如病毒的糞便樣品，將它們分別稀釋于1 L純凈水中，經(jīng)富集后采用Trizol法、硅膠柱法和磁珠法3種方法提取核酸，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR所得的CT值如表1所示。通過比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)硅膠柱法提取核酸檢測到的CT值最小，即檢測出的核酸拷貝數(shù)最高，而經(jīng)Trizol法和磁珠法提取核酸后所測到的CT值比硅膠柱法提取核酸所測到的結(jié)果大，證明硅膠柱法提取核酸效果較好。

2.2 MCE-PEG法富集水中諾如病毒的效果

把含有諾如病毒的糞便懸液原液M樣按10倍系列度稀釋為10-3、10-4、10-5共3個(gè)梯度，每管分裝1 mL。各個(gè)梯度的糞便稀釋液分別加入1 L純凈水中，進(jìn)行MCE-PEG法的第1次及第2次病毒富集。用磁珠法提取病毒核酸，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測所得結(jié)果如表2所示。由于L樣經(jīng)實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測所得的CT值較高，故把其稀釋為10-1，經(jīng)與M樣相同的處理方法所得結(jié)果如表2所示。

設(shè)計(jì)這步試驗(yàn)步驟的主要目的是比較M樣和L樣，以確保貝類成功染毒，為進(jìn)一步試驗(yàn)提供保證。從結(jié)果來看，M樣稀釋了10-5后的CT值比L樣原液小，即M樣原液所含病毒濃度遠(yuǎn)高于L樣原液，可用M樣進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。同時(shí)，對M樣進(jìn)行初步定量，為日后的定量試驗(yàn)提供依據(jù)。此外，MCE-PEG法富集水中諾如病毒，效果顯著，證明本方法可用于富集水中的諾如病毒。

2.3 貝類中諾如病毒檢測結(jié)果

用磁珠法提取的病毒核酸經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，所得數(shù)據(jù)如表3所示?？芍?jīng)染毒的生蠔腸腺組織和腮組織，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果為陽性，而沒有吸附在生蠔組織的病毒及未被染毒的生蠔組織，檢測結(jié)果為陰性，表明這種方法成功模擬自然界中含諾如病毒的貝類，對于成功染毒的生蠔標(biāo)本，該方法可檢測出陽性結(jié)果，而對于沒有吸附在生蠔組織上且沒有進(jìn)行正確富集的病毒，PCR檢測結(jié)果為陰性，證明這種方法可用于檢測貝類中諾如病毒。

3 結(jié)論

本文從核酸提取、MCE-PEG富集和貝類中諾如病毒檢測3個(gè)方面進(jìn)行諾如病毒檢測技術(shù)研究，結(jié)果表明，采用Trizol法、硅膠柱法和磁珠法提取諾如病毒，結(jié)果顯示硅膠柱法提取核酸的CT值最小，核酸濃度最大?？梢?，硅膠柱法提取核酸效果較好，因而本試驗(yàn)采用了硅膠柱法。采用MCE-PEG富集法富集水中諾如病毒，當(dāng)病毒懸液稀釋到10-5時(shí)，仍能用該法成功富集到水中諾如病毒，可見其富集效果有效，且操作簡便，適合基層實(shí)驗(yàn)室作為監(jiān)測方法。采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測染上諾如病毒后的生蠔腸腺組織和蠔腮，與對照組比較，染毒后的生蠔腸腺組織和蠔腮均能檢出病毒，結(jié)果證明這種方法可用于檢測貝類中諾如病毒的試驗(yàn)中。綜上所述，硅膠柱法是這3種方法中提取核酸效果較好的；MCE-PEG法富集水中諾如病毒有效；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)能檢測出染毒貝類中的諾如病毒。

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