蓖麻基因組DNA提取方法研究進(jìn)展

風(fēng)蘭 李國瑞 黃鳳蘭 白英俊 李孟建 孫佳欣 韓雯毓 陳永勝

摘要 目前，基因組DNA的提取已有多種方法，但是不同的方法具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。本文介紹了蓖麻基因組DNA提取原理，并敘述了近年來提取蓖麻基因組DNA的主要方法，如CTAB法、SDS法、試劑盒法、磁性微球法，通過比較這些不同提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)，分析了影響DNA純度的因素，如樣本的采集與保存、提取緩沖液成分的作用、DNA提取純化方法等，以期為蓖麻相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 蓖麻；基因組DNA；提取方法

中圖分類號 S565.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）17-0005-02

Abstract At present，there are many methods for the extraction of genomic DNA，but different methods have their own advantages and disadvantages.In this paper，the principle of plant genomic DNA extraction was introduced，and several main methods of castor genomic DNA extraction in recent years，such as CTAB method，SDS method，kit method and magnetic microsphere method were summarized.The advantages and disadvantages of different methods were compared，and the influencing factors of DNA purity were analyzed，such as sample collection and preservation，the extraction buffer components，and purification methods of DNA，so as to provide theoretical basis for the molecular biology research of castor.

Key words castor；genomic DNA；extraction method

蓖麻（Ricinus communis L.）屬于大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬（Ricinus）油料作物[1]，原產(chǎn)于非洲東部，我國已有逾1 500年的栽培歷史，栽培種植區(qū)主要集中在華北、東北等地區(qū)[2]。蓖麻具有適應(yīng)性廣、綜合利用價(jià)值高[3]、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)。隨著蓖麻被更多地應(yīng)用于社會各個(gè)生產(chǎn)領(lǐng)域，蓖麻遺傳分析等研究也正在迅速發(fā)展。利用分子手段輔助蓖麻科研育種，對促進(jìn)蓖麻產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義[4]。

基因組DNA的提取是蓖麻遺傳性狀分析的基礎(chǔ)，同時(shí)還關(guān)系到蓖麻基因文庫建立、PCR、RFLP、RAPD等分子生物學(xué)研究。因此，快速獲得高質(zhì)量DNA是保證其下游生物學(xué)應(yīng)用的重要前提。在DNA提取過程中，采樣時(shí)間、提取方法及純化技術(shù)等因素均對DNA質(zhì)量有較大影響。目前，常用的蓖麻基因組DNA提取方法為CTAB法[5-8]、SDS法[6，8-9]、磁性微球法[10]以及試劑盒法[11]等。這些方法在原理上大同小異，在DNA提取步驟上主要以組織細(xì)胞裂解破碎、釋放DNA、去除雜質(zhì)及純化DNA等4步為主。本文對現(xiàn)有的蓖麻基因組DNA提取方法進(jìn)行了比較分析，分別敘述其優(yōu)缺點(diǎn)，以期為蓖麻分子生物學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 提取原理

1.1 細(xì)胞裂解破碎

一般情況下，在液氮中磨碎植物的組織和細(xì)胞。液氮處理后，可以使樣品變硬、變脆，更容易裂解；經(jīng)過液氮的速冷后，對樣品進(jìn)行進(jìn)一步研磨時(shí)可以保證DNA充分、均勻地釋放；液氮可以提供一個(gè)低溫環(huán)境，防止DNA被DNA酶降解，從而保證基因組DNA的穩(wěn)定性。

1.2 DNA釋放

細(xì)胞核中的DNA通常以DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物（DNP）的形式存在。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、溴化十六烷三甲基銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）等離子型表面活性劑，具有溶解核膜蛋白和細(xì)胞膜的作用，使核蛋白解聚，從而游離出DNA。

1.3 蛋白質(zhì)去除

核酸通常與某些蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，存在于細(xì)胞核中。因此，將蛋白質(zhì)與核酸分離后才能獲得核酸。提取DNA過程中，一般使用氯仿∶異戊醇（24∶1，v/v）等使蛋白變性，從而留在有機(jī)相或中間相，而DNA則留在水相。在具體操作過程中，可以單獨(dú)使用氯仿∶異戊醇（24∶1，v/v）[12]，也可以增加氯仿∶異戊醇（24∶1，v/v）的抽提次數(shù)[13]。

1.4 次生代謝產(chǎn)物去除

植物細(xì)胞中含有大量的次生代謝產(chǎn)物，如多糖、多酚、脂類、色素等[14]。提取DNA時(shí)，次級代謝產(chǎn)物與DNA共沉淀形成膠體，難以溶解或產(chǎn)生褐變，從而影響DNA的提取和純化[15]。一般在提取介質(zhì)中加入β-巰基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗壞血酸等抗氧化劑，可以有效去除次級代謝產(chǎn)物對DNA的影響[16]。

1.5 RNA去除

高質(zhì)量的DNA應(yīng)不包含或僅含有非常少的RNA。通?？梢杂肦Nase在37 ℃下消化1～2 h，以去除樣品中的RNA。

2 提取方法

蓖麻含有豐富的多糖、多酚和色素等大分子物質(zhì)[8-9]，因此提取蓖麻基因組DNA難度較大。目前，提取蓖麻基因組DNA的主要方法有磁性微球法、試劑盒、SDS法、CTAB法。

2.1 CTAB法

CTAB是一種陽離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜并與核酸形成復(fù)合物。它溶于高鹽溶液（0.7 mol/L NaCl），而當(dāng)鹽濃度降低到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時(shí)，CTAB和核酸形成復(fù)合物，通過離心可從蛋白質(zhì)和多糖中分離出來。將CTAB溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇時(shí)核酸形成沉淀，而CTAB溶于乙醇中[17]。

CTAB法最大優(yōu)點(diǎn)是可以去除酚類和碳水化合物等高分子雜質(zhì)，在提取早期可獲得高含量的DNA，可進(jìn)一步純化獲得高質(zhì)量的DNA[18]。但CTAB法耗時(shí)較長，同時(shí)提取所用試劑均要用原始藥品配制，稍有偏差就會影響DNA提取質(zhì)量。因此，在大量集中提取DNA時(shí)建議選用CTAB法。

王亞[6]通過改良CTAB法，從蓖麻葉片中提取DNA，具體方法：一是將溶解后的DNA加入RNase A去除RNA；二是在提取過程中加入β-巰基乙醇，有效去除酚類物質(zhì)；三是利用氯仿∶異戊醇（24∶1，v/v）抽提，去除蛋白質(zhì)，進(jìn)一步對粗提物進(jìn)行純化。改良的CTAB法得到的蓖麻基因組DNA純度和質(zhì)量較高，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除的較干凈。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得的DNA條帶整齊，亮度高，無拖尾。

2.2 SDS法

SDS是一種陰離子去污劑，可在高鹽條件下溶解細(xì)胞膜以及使蛋白質(zhì)變性。SDS與核酸形成復(fù)合物，通過離心與多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)分開。加入乙醇時(shí)SDS溶解于乙醇中，核酸形成沉淀。采用SDS法提取蓖麻基因組DNA操作簡便，費(fèi)用低廉。

黃文霞等[9]采用了改進(jìn)的SDS法從蓖麻葉中提取DNA。具體的改進(jìn)方法如下：一是采用新鮮葉片，在常溫下用石英砂快速研磨至粉末狀，并迅速轉(zhuǎn)移到含有PVP和β-巰基乙醇的SDS提取液中，從而有效避免了褐變；二是在用氯仿：異戊醇（24∶1，v/v）提取之前，增加一次離心步驟，并用低濃度NaAc沉淀DNA，最后得到較純的DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的DNA條帶較亮，無明顯的模帶。

2.3 試劑盒法

提取蓖麻基因組DNA，也可以用通用的植物基因組DNA提取試劑盒來提取。試劑盒廠家不同，提取步驟也稍有差異。目前用于植物基因組DNA提取的試劑盒普及廣泛，如北京索萊寶科技有限公司、北京莊盟國際生物基因科技有限公司等。

一般情況下，通過試劑盒提取的DNA濃度較高，質(zhì)量較好，且提取耗時(shí)少（一般1～2 h），基本上不再需要酚、氯仿等對人體有害的有機(jī)溶劑。因此，在試驗(yàn)材料較少或試驗(yàn)要求DNA質(zhì)量較高時(shí)建議選用試劑盒法。但試劑盒法較其他方法成本高，是限制其應(yīng)用的重要因素之一。

黃鳳蘭等[11]利用DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取蓖麻葉片DNA并對其提取步驟進(jìn)行了改良優(yōu)化。在原試劑盒的操作基礎(chǔ)上，消化時(shí)間調(diào)整為50 min、用冰預(yù)冷乙醇、將材料用量改為100 mg、使用60 μL洗脫液后，最終獲得了較高質(zhì)量的蓖麻基因組DNA。

2.4 磁性微球法

磁性微球的原理是在NaCl和聚乙二醇（PEG）溶液中，DNA分子團(tuán)聚成球形，其磷酸基團(tuán)能通過氫鍵與硅包覆磁性微球表面的羥基結(jié)合，從而吸附到硅包覆磁性微球表面，與其他蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)分離開來，然后用外加磁場從樣品溶液中分離出載有核酸的磁性微球。經(jīng)過適當(dāng)?shù)那逑慈コ齈EG和NaCl時(shí)，DNA分子從磁性微球表面脫附，得到純化的DNA。

磁性微球法不需要使用有毒化學(xué)試劑、操作簡單、提取率高、周期短，且得到的樣品純度高。

王雅凡等[10]采用溶劑熱方法合成Fe3O4磁性微球，在其表面進(jìn)行硅包覆，將其應(yīng)用于蓖麻葉DNA提取，最后得到了高質(zhì)量的DNA。

3 蓖麻基因組DNA純度的影響因素

3.1 材料選擇

植物組織的選取對基因組DNA的提取有很大影響。健康、幼嫩、處于分裂旺盛階段的植物葉片細(xì)胞，含有更完整的DNA和較少的代謝物。因此，提取基因組DNA時(shí)盡量選擇新鮮、幼嫩的葉片。

3.2 材料保存

采集蓖麻葉片后，立刻置于液氮中進(jìn)行冷凍保存，并且運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)盡快提取基因組DNA?；蛘邚囊旱腥〕龊笾苯臃湃?80 ℃超低溫冰箱中，可長期保存樣品。

3.3 基因組DNA提取過程

3.3.1 離心過程。離心強(qiáng)度要適中。離心強(qiáng)度過強(qiáng)時(shí)，可能會導(dǎo)致沉淀重新溶解困難；而如果轉(zhuǎn)速不夠或者時(shí)間過短時(shí)，產(chǎn)生的葉綠素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)過多。

3.3.2 水浴過程。水浴過程中，不能采用機(jī)械振蕩方式，應(yīng)采用搖晃法混勻，否則會影響DNA提取的效果。

3.3.3 研磨過程。研磨方法和速度等是影響基因組DNA提取純度的重要因素。必須將蓖麻材料在液氮速冷的條件下快速研磨，同時(shí)要控制研磨速度，保證提取的DNA含量和純度更高。在加入提取液之前必須保持冷凍狀態(tài)，否則會影響DNA提取的質(zhì)量。

3.4 基因組DNA提取條件

3.4.1 溫度?；蛱崛∵^程中，如果溫度太高（超過15 ℃），DNA可能會斷裂。因此，提取過程應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。在夏季高溫時(shí)，可在冰浴條件下進(jìn)行DNA的提取。水浴時(shí)間對DNA的提取效果也有一定的影響。水浴保溫是為了在高溫（65 ℃）下鈍化內(nèi)源性核酸酶的活性，一般為30～60 min[19]。

3.4.2 機(jī)械強(qiáng)度。機(jī)械強(qiáng)度越大，DNA分子越容易發(fā)生斷裂。因此，在提取過程中要操作輕緩柔和，同時(shí)盡量避免溶液反復(fù)轉(zhuǎn)移和劇烈震蕩[19]。在轉(zhuǎn)移DNA溶液時(shí)可以剪去槍頭的尖部，吸取時(shí)盡量避免因反復(fù)吸打而產(chǎn)生氣泡[20]。

4 結(jié)語

基因組DNA的提取是蓖麻分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，只有在獲得高質(zhì)量基因組DNA時(shí)，才能更好地進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)試驗(yàn)[21-22]。近年來，在農(nóng)作物中對蓖麻的研究逐漸增多，對其基因組的探究也越來越深入。因此，在蓖麻分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究中，基因組DNA提取方法的改良尤為重要。對蓖麻已有的4種基因組DNA提取方法比較而言，如果要求DNA質(zhì)量較高時(shí)建議選擇試劑盒法；而大量集中提取DNA且DNA質(zhì)量要求不高時(shí)，這4種方法都可以，但在經(jīng)濟(jì)條件允許的情況下還是建議優(yōu)先選擇試劑盒法，因?yàn)樵摲椒ê臅r(shí)短、操作簡單且易獲得高質(zhì)量DNA。在后續(xù)研究中，無論是選擇哪種方法，仍然需要進(jìn)一步優(yōu)化，可從試劑的選擇、材料處理、藥品濃度和操作次數(shù)等多個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，從而找出一種最適合的蓖麻基因組DNA提取方法。

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