舒筋祛痹湯對(duì)腰椎間盤突出癥大鼠PLA2活性、IL-6、TNF-α水平和椎間盤退變的影響

王裕祥 ，楊應(yīng)忠 ，秦衛(wèi)春 ，王衛(wèi)東 ，張瑩

（1.西寧市第二人民醫(yī)院骨科，青海 西寧 810003；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；3.青海省中醫(yī)院；4.西寧市中醫(yī)院）

近年來，腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）的患病率不斷增長(zhǎng)，炎癥介質(zhì)在神經(jīng)根病變導(dǎo)致的LDH中起著至關(guān)重要的作用，如腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1（Interleukins-1，IL-1）、IL-6 等。而早在上世紀(jì)九十年代國(guó)外學(xué)者Ozaktay等[1]通過實(shí)驗(yàn)在兔子腰關(guān)節(jié)囊、附近組織中注入磷脂酶A2（Phospholipase A2，PLA2），解剖后證實(shí)了在突出椎間盤髓核中PLA2具有高度引起局部炎癥的特性。本實(shí)驗(yàn)通過觀察舒筋祛痹湯對(duì)大鼠LDH模型髓核中PLA2活性及血清IL-6、TNF-α及椎間盤退變的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取3月齡清潔級(jí)SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量（240±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供（許可證號(hào)為SCSK（京）2001-0001）；每籠5只，分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，環(huán)境控制：溫度約22℃，濕度約65%。采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只雄性大鼠均分為正常組、模型組、給藥組，每組20只。除正常組大鼠正常環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)以外，西醫(yī)組、中醫(yī)組建立LDH大鼠模型。

1.2 藥物與試劑 中藥舒筋袪痹湯方藥組成：當(dāng)歸、丹參各20 g，獨(dú)活、威靈仙、雞血藤各15 g，桃仁、紅花、川芎、青風(fēng)藤、海風(fēng)藤各10 g，制川烏、制草烏各6 g；購(gòu)自北京同仁堂藥店，鑒定為正品；加冷水500 mL，浸泡30 min后煮沸，并按臨床方法制備藥液，濃縮至200 mL，含生藥4.5 g/mL，臨用前用蒸餾水稀釋至所需濃度即可。雙氯芬酸鈉腸溶片（國(guó)藥準(zhǔn)字H41022703，批號(hào)100813，南陽(yáng)普康藥業(yè)有限公司）；青霉素鉀（國(guó)藥準(zhǔn)字H12021126，批號(hào)030325，天津南華制藥有限公司）；碘伏溶液（國(guó)藥準(zhǔn)字H52020884，批號(hào)100916，遵義華衛(wèi)制藥有限公司）；硫化鈉溶液（國(guó)藥準(zhǔn)字H21022984，批號(hào)100930，遼寧天龍藥業(yè)有限公司）；大鼠IL-6、TNF-α ELISA測(cè)定試劑盒（北京瑞格博科技有限公司）。

1.3 制備模型 大鼠雙前肢剪毛，常規(guī)清潔處理后以碘伏消毒上肢皮膚。以8%硫化鈉溶液去掉大鼠背部被毛，次日腹腔注射10%水合氯醛2 mL/kg完成麻醉。參考文獻(xiàn)[2]建立LDH大鼠模型：于尾根部切斷尾椎（距肛門約1 cm），取出尾椎的一個(gè)髓核及椎間盤周圍軟組織后常規(guī)縫合傷口。以L5棘突為中心取背部正中縱行切口，沿棘突兩側(cè)剝離骶棘肌并向兩側(cè)分開，顯露雙側(cè)L4、L5椎板，咬除其對(duì)應(yīng)棘突及右側(cè)椎板，將之前取出的自體尾椎髓核輕輕放于硬膜外腔對(duì)應(yīng)L4-L5神經(jīng)根位置，操作時(shí)避免對(duì)脊髓、神經(jīng)根造成勿壓，最后縫合傷口。待大鼠麻醉蘇醒后，飼養(yǎng)籠喂養(yǎng)3 d，期間腹腔注射青霉素80000 U預(yù)防感染并促進(jìn)尾部傷口快速收口結(jié)痂；于7 d后行X線攝片檢查，腹腔注射10%水合氯醛（40 mg/kg）麻醉，使用高分辨率數(shù)字小動(dòng)物X線機(jī)行腰椎側(cè)位片檢查，若X線片提示模型大鼠下腰椎間隙變窄且椎體前緣出現(xiàn)唇緣樣增生，則制模成功。

1.4 分組與給藥正常組大鼠正常環(huán)境下下飼養(yǎng)；西醫(yī)組大鼠給予雙氯芬酸鈉腸溶片連續(xù)灌胃給藥14 d，以成人公斤體重的每日臨床用藥劑量為參考，以人鼠比例單位體重所占體表面積的比值進(jìn)行換算后計(jì)算最終劑量；中醫(yī)組大鼠給予舒筋袪痹湯進(jìn)行灌胃給藥14 d，折合生藥2.5 g/d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 髓核中PLA2活性 于制模后3、7、14 d各組分別取6個(gè)移植髓核標(biāo)本保存于-80℃冰箱。樣本在60℃水浴30 min后冷卻，置4℃冰箱備用，取2只25 mL燒杯分別作為A管和B管。B管加入8 mL底物緩沖液，1.1 mL乙二胺四乙酸，樣本0.4 mL；8 mL A管加入底物緩沖液，0.2 mL CaCl2溶液，樣本0.4 mL。37℃水浴后，B管加入0.2 mL CaCl2溶液，A管再加入1.1 mL乙二胺四乙酸，混勻后以高靈敏度pH計(jì)測(cè)量A管、B管的pH值，以微量吸槍吸取新標(biāo)定的稀鹽酸將B管的pH滴定至與A管的相同的pH值，PLA2的活力通過所消耗的鹽酸測(cè)定：1個(gè)PLA2活性單位規(guī)定為在37℃下，每分鐘每毫升樣本反應(yīng)消耗1 nmol鹽酸。PLA2（U）=所消耗鹽酸濃度（mol/L）×體積（mL）×106×2.5/反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.5.2 血清IL-6、TNF-α測(cè)定 于制模后第14天將各組大鼠分別固定于鍘刀，在枕骨大孔水平斷頭處死。各組大鼠均采用斷頭后迅速倒置，離心管收集全血5 mL，4℃下靜置3 h，3000 r/min離心機(jī)內(nèi)離心處理15 min，取上清于-20℃冰箱保存待測(cè)。采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定血清IL-6、TNF-α濃度。

1.5.3 神經(jīng)根組織形態(tài)學(xué)觀察 斷頭處死大鼠后，從腹腔解剖入路暴露L5神經(jīng)根，取長(zhǎng)約2 mm的神經(jīng)根組織，以10%甲醛浸泡固定，4℃冰箱保存。切片觀察：自神經(jīng)根組織分叉近端開始切片，厚度5 μm，然后實(shí)施常規(guī)脫蠟、H-E染色、脫水、中性樹脂封片，最后光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)根組織的病理改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 研究數(shù)據(jù)選用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析和處理，計(jì)數(shù)資料采取率（%）表示，對(duì)比進(jìn)行 χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采取（±s）表示，進(jìn)行獨(dú)立 t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 PLA2活性比較 制模成功經(jīng)大鼠灌胃后第3天，中藥組、西藥組大鼠髓核組織中PLA2活性達(dá)到最高，均顯著高于正常組（P＜0.05）；此時(shí)中藥組髓核組織中PLA2活性略高于西藥組，但差異無顯著性（P＞0.05）。第7、14天中藥組、西藥組髓核組織中的PLA2活性均顯著較第 3天降低（P＜0.05），且第 7、14天中藥組髓核組織中PLA2活性均略低于西藥組，但差異無顯著性（P＞0.05）。見表1。

表1 三組大鼠髓核組織中PLA2活性比較（±s，ng/mL）

表1 三組大鼠髓核組織中PLA2活性比較（±s，ng/mL）

注：表中正常組未制模，飼養(yǎng)同時(shí)段為數(shù)據(jù)；與同組制模后第3天比較，△P＜0.05；與正常組比較，▲P＜0.05。

組別 n 制模后第3天 制模后第7天 制模后第14天正常組 20 25.86±4.42 24.41±4.72 24.62±4.14西藥組 20 48.66±7.50▲ 39.12±7.13△▲ 34.11±6.49△▲中藥組 20 50.92±8.71▲ 37.97±7.34△▲ 32.30±6.97△▲

2.2 IL-6、TNF-α濃度比較 制模成功經(jīng)大鼠灌胃后第14天，西藥組、中藥組血清IL-6、TNF-α濃度略高于正常組，但差異無顯著性（P＞0.05）；且中藥組血清IL-6、TNF-α濃度略低于西藥組，但差異無顯著性（P＞0.05）。見表2。

表2 三組大鼠血清IL-6、TNF-α 濃度比較（±s）

表2 三組大鼠血清IL-6、TNF-α 濃度比較（±s）

組別 n IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L）正常組 20 12.35±2.70 78.86±7.42西藥組 20 14.03±3.15 82.65±7.50中藥組 20 13.57±2.66 80.92±7.71

2.3 三組大鼠神經(jīng)根組織形態(tài)學(xué)比較 正常組大鼠神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)致密、完整，有髓纖維的髓鞘完整、排列規(guī)則整齊，雪旺細(xì)胞數(shù)量多、大小均勻，軸突表面規(guī)則完整、無水腫。中藥組出現(xiàn)新生的髓鞘，排列較規(guī)則，雪旺細(xì)胞大小基本一致，軸突排列整齊、無水腫；但西藥組髓纖維新生的髓鞘不完整，排列欠規(guī)則，雪旺細(xì)胞數(shù)量較少，且軸突邊緣不清晰，大小不均，仍可見輕度水腫變形，胞質(zhì)內(nèi)可見空泡。見圖1。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為L(zhǎng)DH患者慢性腰腿疼痛多與“正氣虧虛，經(jīng)脈痹阻，經(jīng)筋失衡，氣血失和”有關(guān)，內(nèi)傷勞損、外感及跌仆損傷致腰部筋脈受損、瘀血阻絡(luò)、經(jīng)脈痹阻，加之氣血運(yùn)行不暢致臟腑功能、關(guān)節(jié)不利，不通則痛[3]。故《三因極一病證方論·腰痛病論》有“夫腰痛屬腎虛，亦涉三因所致；在外則臟腑經(jīng)絡(luò)受邪，在內(nèi)則憂思恐怒，以至房勞墮墜，皆能使痛”的描述。舒筋袪痹湯基于LDH的中醫(yī)病因病機(jī)擬定，方中當(dāng)歸、丹參、桃仁、紅花、川芎、雞血藤等可舒筋活絡(luò)、消腫止痛，青風(fēng)藤、海風(fēng)藤、制川烏、制草烏、獨(dú)活、威靈仙等可散寒逐痹、抗炎鎮(zhèn)痛。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，舒筋袪痹湯治療LDH，一方面具有改善組織微循環(huán)和血液流變性，降低毛細(xì)血管通透性和脆性的作用，從而可有效減少損傷局部的組織液外滲；另一方面可改善神經(jīng)血液微循環(huán)，促進(jìn)炎癥因子及致痛因子的代謝，緩解腰腿痛癥狀[4-5]。

圖1 三組大鼠右側(cè)L5神經(jīng)根組織形態(tài)學(xué)觀察示例（×400）

為進(jìn)一步探究舒筋袪痹湯治療LDH的臨床效果，本實(shí)驗(yàn)制作LDH大鼠模型，制模成功后，中藥組給予舒筋袪痹湯經(jīng)大鼠灌胃，并與西藥組、正常組大鼠相比較，發(fā)現(xiàn)灌胃后第3天，中藥組、西藥組大鼠髓核組織中PLA2活性達(dá)到最高，均顯著高于正常組；此時(shí)中藥組髓核組織中PLA2活性略高于西藥組，差異無顯著性，說明在第3天兩組都可以對(duì)髓核組織中的PLA2活性起到抑制作用，但中藥組不如西藥組明顯。在第7、14天，中藥組、西藥組髓核組織中的PLA2活性均顯著較第3天降低，提示均可對(duì)髓核組織中的PLA2活性起到抑制作用。且中藥組髓核組織中PLA2活性略低于西藥組，但差異無顯著性，提示與西藥相比，舒筋祛痹湯同樣能起到抑制炎癥因子、降低髓核組織中PLA2活性的作用。孫江濤等[6]的研究指出，PLA2被發(fā)現(xiàn)在突出髓核中存在后已引起廣泛關(guān)注，認(rèn)為正常機(jī)體內(nèi)PLA2受內(nèi)源性抑制物、促進(jìn)物PLA2激活蛋白的相互影響，二者失衡后，機(jī)體啟動(dòng)PLA2蛋白，PLA2活性增高，這可能也是引起椎間盤組織發(fā)生退變的重要因素，而通過下調(diào)PLA2的活性，可恢復(fù)這種平衡，從而延緩椎間盤的退變。本研究證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制模成功經(jīng)大鼠灌胃后第14天，西藥組、中藥組血清IL-6、TNF-α濃度略高于正常組，但差異無顯著性，提示經(jīng)給藥灌胃后，西藥組、中藥組血清IL-6、TNF-α濃度均得到很好控制，與正常組大鼠炎癥反應(yīng)程度接近；且中藥組血清IL-6、TNF-α濃度略低于西藥組，差異無顯著性，推測(cè)舒筋祛痹湯可能發(fā)揮更好的抗炎功效，與舒筋祛痹湯可明顯降低髓核組織中PLA2活性有關(guān)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

此外，本實(shí)驗(yàn)神經(jīng)根組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示相比于正常組大鼠，中藥組、西藥組大鼠可見髓神經(jīng)纖維脫髓鞘改變、空泡樣變性等病理改變，推測(cè)髓核本身的自身免疫炎性反應(yīng)是引起根性神經(jīng)痛的可能因素，這一點(diǎn)與樸起范[7]的觀點(diǎn)類似。值得注意的是，病理改變方面，本實(shí)驗(yàn)中藥組出現(xiàn)新生的髓鞘，排列較規(guī)則，雪旺細(xì)胞大小基本一致，軸突排列整齊、無水腫；但西藥組髓纖維的新生髓鞘不完整，排列欠規(guī)則，雪旺細(xì)胞數(shù)量較少，且軸突邊緣不清晰，大小不均，仍可見輕度水腫變形，胞質(zhì)內(nèi)可見空泡，提示舒筋祛痹湯對(duì)LDH大鼠模型神經(jīng)根組織形態(tài)的改善作用較為可觀。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中藥舒筋祛痹湯能明顯抑制LDH大鼠移植髓核內(nèi)PLA2活性，從而減輕炎癥介質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)血清IL-6、TNF-α濃度，起到延緩椎間盤退變的作用[8]，這可能是舒筋祛痹湯治療LDH的抗炎鎮(zhèn)痛機(jī)制之一。