經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化療栓塞術(shù)肝癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群與預(yù)后的相關(guān)性

孟志民， 朱 捷， 張春燕， 郭 瑋， 潘柏申， 王蓓麗

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是病死率最高的惡性腫瘤之一。我國每年約有38.3萬人死于肝癌及其并發(fā)癥，占全球肝癌死亡數(shù)的51%[1]。在全球范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率逐年攀升。據(jù)估計，到2025年，每年肝癌的發(fā)病數(shù)將超過100萬例[2]。手術(shù)切除是目前治療肝癌的唯一根治性手段。當(dāng)腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移不宜進行手術(shù)時，常會選擇非手術(shù)手段對疾病進行干預(yù)，如經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）術(shù)。TACE術(shù)的治療原理是將導(dǎo)管插入腫瘤供血動脈后，使用栓塞劑將靶動脈封閉，從而使腫瘤組織缺血壞死，縮小腫瘤。但TACE術(shù)的預(yù)后卻因人而異，其原因之一是患者自身免疫狀況不同。機體的免疫情況與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，免疫細(xì)胞能直接參與腫瘤炎癥微環(huán)境的形成及腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視、逃逸[3-4]。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中淋巴細(xì)胞亞群的分布可以有效地反映人體免疫狀況。鑒于肝癌患者TACE術(shù)后尚無有效的標(biāo)志物對預(yù)后進行有效的判斷，本研究擬分析肝癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群分類與TACE術(shù)預(yù)后之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年7月—2016年6月至復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診并行TACE術(shù)治療的肝癌初診患者214例，其中男183例、女31例，年齡38～67歲。肝癌依據(jù)國家衛(wèi)生計生委2011年版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》診斷，術(shù)前未接受過放療、化療等相關(guān)治療。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲，明確診斷為HCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他腫瘤病史；（2）合并有其他惡性腫瘤；（3）入院前經(jīng)過外院治療。

患者預(yù)后情況判斷：患者經(jīng)TACE術(shù)治療，6個月后行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢查，由2位影像學(xué)醫(yī)師對患者的MRI資料進行雙盲審查。預(yù)后情況分為疾病進展（progressive disease，PD；靶病灶最大徑之和至少增加≥20%，出現(xiàn)新病灶）、疾病穩(wěn)定[stable disease，SD；靶病灶最大徑之和縮小未達部分緩解（partial response，PR），或增大未達PD]、PR（靶病灶最大徑之和減少≥30%，至少維持4周）、完全緩解（complete response，CR；所有靶病灶消失，無新病灶出現(xiàn)，且腫瘤標(biāo)志物正常，至少維持4周）。因本研究入組人群無CR者，故將PR和SD者歸為疾病穩(wěn)定組（134例），PD歸為疾病進展組（80例）。

收集所有患者的一般臨床資料。疾病穩(wěn)定組與疾病進展組之間一般臨床資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 疾病穩(wěn)定組與疾病進展組一般臨床資料的比較 （例）

1.2 檢測方法

采集所有患者術(shù)前乙二胺四乙酸抗凝全血樣本。采用FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）及配套6色TBNK試劑盒檢測淋巴細(xì)胞亞群。取全血樣本50 μL與20 μL抗體[CD3-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/CD16-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）/CD56-PE/CD45-多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物-花青苷5.5（peridinin-chlorophyll-protein complex-cyanin 5.5，PerCP-Cy 5.5）/CD4-藻紅蛋白-花青苷7（phycoerythrin- cyanin 7，PE-Cy 7）/CD19-別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）/CD8-別藻藍(lán)蛋白-花青苷 7（allophycocyanin- cyanin 7，APC-Cy 7）]混勻孵育15 min，加入紅細(xì)胞裂解液450 μL，混勻孵育10 min，然后上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0和Graph prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用配對t檢驗。采用Logistic回歸分析評估患者臨床信息與檢測指標(biāo)之間的關(guān)系及肝癌患者TACE術(shù)預(yù)后的危險因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者TACE術(shù)前淋巴細(xì)胞亞群分析

疾病穩(wěn)定組CD4+細(xì)胞百分比、CD4+CD8+細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+比值均明顯低于疾病進展組（P＜0.05），而CD19+細(xì)胞百分比、CD3+細(xì)胞百分比、CD8+細(xì)胞百分比和CD56+細(xì)胞百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 疾病進展組與疾病穩(wěn)定組淋巴細(xì)胞亞群分類比較 （±s）

表2 疾病進展組與疾病穩(wěn)定組淋巴細(xì)胞亞群分類比較 （±s）

組別 例數(shù) CD19+細(xì)胞（%） CD3+細(xì)胞（%） CD4+細(xì)胞（%）疾病穩(wěn)定組 134 15.52±7.80 65.24±10.87 39.69±7.01疾病進展組 80 14.96±6.39 67.51±9.37 42.97±8.18 P值 0.569 0.122 0.002組別 CD8+細(xì)胞（%） CD56+細(xì)胞（%） CD4+CD8+細(xì)胞（%） CD4+/CD8+比值疾病穩(wěn)定組 22.79±7.67 16.55±7.81 2.31±1.45 1.99±0.96疾病進展組 21.13±6.52 14.40±7.52 3.10±2.29 2.29±1.08 P值 0.109 0.051 0.003 0.031

2.2 肝癌患者預(yù)后的二元Logistic回歸分析

根據(jù)第75百分位數(shù)將CD4+細(xì)胞百分比、CD4+CD8+細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值各分為2組：＜46%組和≥46%組、＜3%組和≥3%組、＜2.5組和≥2.5組。單因素回歸分析顯示：性別、腫瘤數(shù)量、CD4+細(xì)胞百分比、CD4+CD8+細(xì)胞百分比與TACE術(shù)后肝癌患者的預(yù)后存在關(guān)聯(lián)[比值比（odds ratio，OR）值分別為0.432、1.978、2.896、1.293，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為0.200～0.934、1.123～3.484、1.531～5.478、1.080～1.593]。多因素回歸分析顯示腫瘤數(shù)量、CD4+細(xì)胞百分比和CD4+CD8+細(xì)胞百分比是TACE術(shù)后肝癌患者預(yù)后的獨立危險因素（OR值分別為1.931、3.096、2.105，95%CI分別為1.058～3.526、1.584～6.052、1.079～4.108）。見表3。

2.3 不同CD4+CD8+及CD4+細(xì)胞百分比的患者在疾病穩(wěn)定組和疾病進展組中的比例

表3 肝癌患者預(yù)后的二元Logistic回歸分析

疾病穩(wěn)定組中CD4+細(xì)胞百分比≥46%者占17.16%，CD4+CD8+細(xì)胞百分比≥3%者占19.40%，均明顯低于疾病進展組（37.50%、33.75%）（P＜0.05）。見圖1、圖2。

3 討論

圖 1 不同CD4+CD8+細(xì)胞百分比患者在疾病穩(wěn)定組和疾病進展組中的比例

圖 2 不同CD4+細(xì)胞百分比患者在疾病穩(wěn)定組和疾病進展組中的比例

肝癌是世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一。使用手術(shù)方式將癌變組織及腫瘤切除是肝癌治療的首選方法，但有近40%的中晚期患者因為腫瘤過大或已發(fā)生播散轉(zhuǎn)移，不適合使用切除術(shù)[5]，轉(zhuǎn)而依據(jù)BCLC評分以及患者自身狀況，選擇TACE術(shù)或射頻消融術(shù)對腫瘤進行干預(yù)性治療。有部分患者在TACE術(shù)后腫瘤依然持續(xù)性進展，這與患者自身的免疫狀況有關(guān)。

T淋巴細(xì)胞亞群是人體免疫系統(tǒng)中最主要的抗腫瘤免疫方式[6]。T淋巴細(xì)胞可依據(jù)表面標(biāo)志物的差異分為CD4+細(xì)胞及CD8+細(xì)胞，兩者在機體免疫中發(fā)揮著不同的作用?；罨腃D4+細(xì)胞通過分泌多種細(xì)胞因子提升其他免疫細(xì)胞的免疫功能，如促進B細(xì)胞分泌抗體、刺激自然殺傷細(xì)胞分泌γ-干擾素（interferon gamma，IFN-γ）等，從而激活機體整體的免疫反應(yīng)，CD4+細(xì)胞可以進一步分為輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）1細(xì)胞、Th2細(xì)胞以及Th17細(xì)胞，它們可分泌不同的細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在抵御感染、腫瘤、自身免疫性疾病中發(fā)揮作用。CD8+細(xì)胞通過Fas-FsaL途徑、穿孔素、IFN-γ、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等直接殺傷靶細(xì)胞，是抗腫瘤免疫中最主要的免疫細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，疾病進展組CD4+細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值均高于疾病穩(wěn)定組（P＜0.05）。表明在腫瘤進展過程中，人體內(nèi)存在明顯的免疫炎癥反應(yīng)，隨著腫瘤負(fù)荷的增加，炎癥程度也進一步增強，機體處于免疫激活狀態(tài)。侯恩存等[7]比較了肝癌患者TACE術(shù)術(shù)前與術(shù)后淋巴細(xì)胞亞群的比例，結(jié)果顯示TACE術(shù)后，隨著腫瘤負(fù)荷的減輕，人體內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群的比例也逐漸恢復(fù)至較為正常的水平。

CD4+CD8+細(xì)胞是一類具有獨特免疫功能的T淋巴細(xì)胞[8]，可以在炎癥及腫瘤免疫中發(fā)揮作用。QUANDT等[9]認(rèn)為這類細(xì)胞同時具有CD4+及CD8+細(xì)胞的特性，可以分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）21、IL-4和IFN-γ等細(xì)胞因子，在機體免疫的過程中發(fā)揮著獨特的作用。DESFRANCOIS等[10-11]的研究結(jié)果顯示腫瘤浸潤的CD4+CD8+細(xì)胞可以分泌IL-13、IL-4和TNF-α，直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制其生長并將其殺死。WANG等[12]的研究結(jié)果顯示，肝癌患者的CD4+CD8+細(xì)胞會異常表達STAT3磷酸化蛋白，能促進IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10分泌，在炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。另外，其他類型的免疫細(xì)胞也與腫瘤有關(guān)。PAN等[13]的研究結(jié)果顯示，采用過繼免疫療法在患者體內(nèi)輸注細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（cytokineinduced killer，CIK）淋巴細(xì)胞可以有效抑制肝癌的進展，延緩或阻止腫瘤切除術(shù)后肝癌的復(fù)發(fā)。ZHENG等[14]的研究結(jié)果顯示，肝癌患者的CXCR3+效應(yīng)T細(xì)胞及CD62L+T細(xì)胞在經(jīng)TACE術(shù)治療后會明顯升高，提示其與腫瘤相關(guān)。不同亞類的T細(xì)胞在抗腫瘤方面具有不同的作用。CD4+CD8+細(xì)胞作為近幾年來新發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的具體機制尚不明確，值得進一步研究。

綜上所述， TACE術(shù)前CD4+CD8+細(xì)胞百分比是肝癌預(yù)后不良的獨立危險因素，可作為一種潛在的指標(biāo)輔助臨床判斷肝癌患者TACE術(shù)的預(yù)后。本研究也存在一定的不足之處：（1）未進一步探討相關(guān)的免疫細(xì)胞通過何種途徑影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；（2）僅僅分析了基本的淋巴細(xì)胞亞類，未進一步細(xì)分是何種類型的T淋巴細(xì)胞與肝癌的復(fù)發(fā)有關(guān)。因此，在后續(xù)的研究中，我們將進一步對已發(fā)現(xiàn)的結(jié)果展開分析，完善本研究得出的結(jié)論。