窄譜中波紫外線對體外培養(yǎng)人黑素細胞自噬水平的影響

王敏 耿清偉 高亞麗 華優(yōu) 宋秀祖

310009杭州，安徽醫(yī)科大學杭州臨床學院 杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

自噬是真核細胞一種重要代謝過程，通過溶酶體降解細胞內變性的蛋白質、細胞器等物質以維持正常生理功能。既往研究證實[1?4]，白癜風患者黑素細胞存在自噬異常，通過促進自噬恢復黑素細胞正常生理功能可能對白癜風的治療具有重要意義。窄譜中波紫外線（NB?UVB）治療白癜風效果顯著，既往研究已經證實，NB?UVB可以促進黑素細胞增殖、黑素合成及黑素細胞遷移，但具體機制尚未完全闡明[5]。本研究擬觀察NB?UVB對黑素細胞自噬水平及自噬信號途徑的影響，進一步明確NB?UVB治療白癜風的機制。

資料與方法

1.細胞、試劑及儀器：經杭州市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準同意并獲得患者知情同意，人黑素細胞取自本院泌尿外科包皮環(huán)切廢棄皮膚，按文獻[6]方法采用Hu16完全黑素細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。單丹（磺）酰戊二胺（MDC）為美國Sigma公司產品。鼠抗磷酸化磷酸腺苷蛋白激酶（p?AMPK）單克隆抗體、兔抗磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p?mTOR）單克隆抗體、兔抗微管相關蛋白輕鏈3（LC3）多克隆抗體及鼠抗P62單克隆抗體（美國Abcam公司）；SS?01型NB?UVB輻照儀（上海希格瑪高技術有限公司），NB?UVB輻照儀（美國Solarlight公司）經過Solar PMA輻射計校正。圖像采集使用Olympus BX?51熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2.NB?UVB照射：體外培養(yǎng)的人黑素細胞接種至培養(yǎng)皿中，待細胞生長至80%融合時進行NB?UVB照射。照射前除去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗1次后，加入薄層PBS，以剛好覆蓋細胞為度。NB?UVB照射劑量設定0、50、100及200 mJ/cm2四組（照射時間分別為0、5、9及18 s）。照射后除去上覆的PBS，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。

3.MDC染色法標記自噬體：黑素細胞經NB?UVB照射后24h，加入5 mmol/L MDC，調整MDC終濃度為0.05 mmol/L。再放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育30 min。除去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定40 min。熒光顯微鏡觀察拍照，細胞內散在亮綠色熒光即為自噬體。每個細胞內自噬體超過3個為自噬體陽性細胞。每組選擇8個視野，對各組細胞進行自噬體陽性細胞計數并統(tǒng)計陽性百分率。

4.免疫印跡檢測自噬信號表達：黑素細胞經NB?UVB照射后24h，常規(guī)提取蛋白并定量。將定量后的蛋白進行凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉膜，5%脫脂牛奶液室溫封閉1h。分別加入兔抗p?mTOR、LC3抗體及鼠抗p?AMPK、P62抗體，4℃孵育過夜，TBST液洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶（HPR）標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，室溫孵育1h，TBST液洗膜3次。化學發(fā)光法檢測目的條帶，用Image J軟件分析條帶的灰度值，以目的片段與β肌動蛋白灰度比值作為蛋白表達水平進行統(tǒng)計學分析。

5.透射電鏡觀察超微結構：黑素細胞經NB?UVB照射后24h，消化離心收集細胞，2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，乙醇梯度脫水，丙酮處理，包埋，切片及染色，透射電鏡下觀察。每組選擇8個視野觀察與拍照，計數黑素小體、自噬體及自噬溶酶體。

6.統(tǒng)計學分析：采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組間MDC染色、免疫印跡結果采用單因素方差分析比較，SNK法進行兩兩比較。黑素小體、自噬體與自噬溶酶體數量采用Kruskal?Wallish檢驗進行統(tǒng)計分析，并用Mann?Whitney檢驗進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.MDC法測定黑素細胞自噬體變化：熒光顯微鏡下黑素細胞核周可見亮綠色熒光聚集，4組間自噬體陽性細胞百分率（表1）差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），100、200 mJ/cm2組均顯著高于對照組和50 mJ/cm2組，與對照組相比，q值分別為6.75、10.68；與50 mJ/cm2組相比，q值分別為5.55、8.48；均P＜ 0.05。而50 mJ/cm2組與對照組、200 mJ/cm2與100 mJ/cm2組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（q值分別為0.76、1.11，均P＞ 0.05）。見圖1、表1。

圖1 不同劑量NB?UVB照射黑素細胞后MDC染色變化 與對照組相比，50 mJ/cm2組自噬體陽性細胞（白色箭頭）數量無明顯增多；100和200 mJ/cm2組顯著增多

表1 不同劑量NB?UVB照射黑素細胞后自噬體染色陽性率、黑素小體數量、自噬體與自噬溶酶體數量以及免疫印跡檢測自噬相關蛋白表達變化（±s）

表1 不同劑量NB?UVB照射黑素細胞后自噬體染色陽性率、黑素小體數量、自噬體與自噬溶酶體數量以及免疫印跡檢測自噬相關蛋白表達變化（±s）

注：n=8。以目的片段與β肌動蛋白灰度比值作為自噬相關蛋白表達水平。aF值；bH值

自噬相關蛋白組別對照組50 mJ/cm2組100 mJ/cm2組200 mJ/cm2組F/H值P值自噬體染色陽性率（%）21.83±3.50 23.66±4.12 38.08±4.10 40.23±1.45 37.88a＜0.05黑素小體（個/視野）18.50±4.18 39.12±9.42 57.38±7.11 59.75±15.15 23.58b＜0.05自噬體與自噬溶酶體（個/視野）1.88±1.18 2.88±1.36 5.12±1.13 5.25±1.04 20.73b＜0.05 p?AMPK 0.40±0.02 0.51±0.04 0.85±0.05 0.84±0.06 105.05a＜0.05 p?mTOR 0.82±0.03 0.81±0.04 0.64±0.04 0.63±0.01 37.03a＜0.05 LC3Ⅱ/Ⅰ1.06±0.04 1.11±0.04 1.49±0.09 1.47±0.08 41.81a＜0.05 P62 0.94±0.08 0.99±0.10 0.63±0.05 0.69±0.02 25.62a＜0.05

2.免疫印跡法檢測p?AMPK、p?mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62的表達：見表1。4組間p?AMPK、p?mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62表達差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。100、200 mJ/cm2組p?AMPK表達量顯著增多，與對照組比，q值分別為 17.34、13.38；與 50 mJ/cm2組比，q值分別為11.20、9.03；均P＜ 0.05；LC3Ⅱ/Ⅰ表達亦顯著增加，與對照組比，q值分別為8.40、8.51；與50 mJ/cm2組比，q值分別為7.33、7.35；均P＜ 0.05。p?mTOR及P62蛋白表達量顯著下調，p?mTOR與對照組相比，q值分別為7.47、11.34；與50 mJ/cm2組相比，q值分別為5.80、7.43；P62與對照組相比，q值分別為 6.29、5.55；與 50 mJ/cm2組相比，q值分別為6.58、5.89，均P＜ 0.05。見圖2、表1。

圖2 免疫印跡法檢測NB?UVB照射黑素細胞后p?AMPK、p?mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62的表達 1 ～ 4：分別為0（對照組）、50、100、200 mJ/cm2組。100、200 mJ/cm2組p?AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ表達顯著增加，而p?mTOR及P62蛋白表達量顯著下降

3.透射電鏡觀察自噬體、自噬溶酶體及黑素小體變化：黑素細胞中見清晰的黑素小體，呈致密深黑色圓形或橢圓形顆粒狀結構，著色程度不同，散在或聚集分布。同時可見雙層膜狀結構的自噬體、單層膜結構的自噬溶酶體。4組間自噬體與自噬溶酶體數量差異有統(tǒng)計學意義（H=20.731，P＜0.05）。見表1。100、200 mJ/cm2組自噬體與自噬溶酶體數量顯著增多，與對照組比，Z值分別為3.26、3.30，與 50 mJ/cm2組比，Z值分別為 2.86、3.03，均P＜ 0.05；200mJ/cm2組與100mJ/cm2組相比、50mJ/cm2組與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（Z值分別為0.27、1.48，均P＞ 0.05）。

4組間黑素小體數量差異也有統(tǒng)計學意義（H=23.583，P＜ 0.05）。50、100、200 mJ/cm2組與對照組相比，黑素小體數量均顯著增多（Z值分別為3.37、3.37、3.37，均P＜ 0.05）；100、200 mJ/cm2組分別與50 mJ/cm2組相比，差異有統(tǒng)計學意義（Z值分別為3.10、2.52，均P＜ 0.05）；100 mJ/cm2組與200 mJ/cm2組相比差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.42，P＞ 0.05）。見圖3、表1。

討 論

白癜風發(fā)病機制尚未明確，遺傳、環(huán)境、氧化應激、自身免疫等因素均可能與其發(fā)病相關[7?8]。近年來研究表明，自噬在白癜風的發(fā)病中亦發(fā)揮重要作用[3]。自噬缺陷的黑素細胞可導致氧化還原失衡，從而破壞黑素細胞，可能與白癜風的發(fā)病機制相關[9]。進一步研究證實，誘導白癜風患者皮損周圍黑素細胞自噬，發(fā)現黑素細胞的小眼畸形相關轉錄因子、酪氨酸酶及酪氨酸酶相關蛋白1表達均顯著升高，促進黑素合成[10]。因此推測自噬參與了白癜風的發(fā)生、發(fā)展過程。

既往研究[11?12]證實，NB?UVB照射能促進黑素細胞增殖及黑素合成，并且可以促進黑素細胞遷移，在白癜風復色中發(fā)揮作用。NB?UVB還可通過下調黑素細胞miRNA?25的表達，促進黑素細胞增殖，增加酪氨酸酶活性及黑素生成[11?12]。既往研究發(fā)現[13?14]，適宜劑量的UVB照射可以促進HaCaT細胞及人皮膚成纖維細胞自噬。我們的前期研究觀察到，UVB具有促進表皮細胞自噬的作用[15]。本研究首先觀察了NB?UVB對正常黑素細胞自噬的影響，結果顯示，100、200 mJ/cm2NB?UVB照射正常黑素細胞，MDC染色強度顯著增強，染色陽性細胞數量增多，表明NB?UVB可以促進正常黑素細胞發(fā)生自噬。

為進一步確證自噬的發(fā)生，我們采用透射電鏡觀察了正常黑素細胞的超微結構變化。結果顯示，正常黑素細胞中黑素小體隨著NB?UVB照射劑量的增大而增多，細胞質內可見較多單層膜空泡狀的自噬溶酶體及較少的雙層膜自噬體。而100、200 mJ/cm2NB?UVB照射組與對照組相比，自噬體及自噬溶酶體形成顯著增多，證實NB?UVB照射對正常黑素細胞自噬具有促進作用。Zhang等[16]研究發(fā)現，缺乏自噬蛋白Atg7的黑素細胞出現早衰，細胞內累積了較多的氧化損傷產物、泛素化蛋白及銜接蛋白P62，并導致自噬缺陷小鼠出現表皮輕度色素減退。此外，有研究[17]發(fā)現，結節(jié)性硬化癥患者的色素減退斑與黑素細胞自噬失調相關。結合我們的研究結果及以往研究報道，推測NB?UVB可通過上調黑素細胞的自噬水平促進黑素細胞存活，在白癜風治療中發(fā)揮作用。

圖3 透射電鏡觀察黑素細胞經不同劑量NB?UVB照射后黑素小體、自噬體與自噬溶酶體數量的變化 A：自噬體與自噬溶酶體；M：黑素小體。黑素小體數量的變化：對照組細胞核旁見少量黑素小體，部分聚集；50 mJ/cm2組可見胞質中較為稀疏的黑素小體，較對照組稍增多；100與200 mJ/cm2組均見胞質中密集分布的黑素小體。自噬體與自噬溶酶體：對照組可見自噬體和自噬溶酶體；50 mJ/cm2組較對照組稍增多；100與200 mJ/cm2組均較對照組與50 mJ/cm2組顯著增多

AMPK/mTOR信號途徑是自噬的重要信號通路[18]。LC3是自噬的標志蛋白，LC3Ⅰ轉化為LC3Ⅱ的水平標示著自噬的活化程度[19]。P62是選擇性自噬途徑中的重要蛋白，其作為泛素化蛋白與自噬囊泡銜接蛋白，將泛素化蛋白轉運至自噬體中降解，其蛋白表達與自噬強度成反比，自噬缺陷的細胞中常觀察到P62蓄積[20?21]。我們的研究表明，NB?UVB照射培養(yǎng)的人正常黑素細胞，可以抑制其p?mTOR信號活化，促進p?AMPK活化從而誘導自噬發(fā)生。進一步研究觀察到，LC3Ⅱ/Ⅰ顯著升高，P62蛋白表達顯著下降。Bridgeman等[22]研究表明，芹菜素可通過活化AMPK，抑制mTOR信號通路，調節(jié)UVB照射誘導的角質形成細胞自噬水平。

綜上所述，NB?UVB照射正常黑素細胞，可以活化其自噬信號通路，促進自噬相關蛋白表達，誘導自噬體和自噬溶酶體增加。推測NB?UVB治療白癜風的機制可能與其提高白癜風患者黑素細胞的自噬水平相關，進一步的動物或臨床試驗可加以證明。