核酸等溫擴增技術(shù)在水產(chǎn)病原體快速檢測中的應(yīng)用

龐建虎, 喬龍亮, 朱 鵬，, 高威芳, 章禮萍

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 寧波 315211;2.寧波海洋研究院,浙江 寧波 315832 )

近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)生的經(jīng)濟效益都是空前的.目前，我國水產(chǎn)品產(chǎn)量占動物性食物的1/3，處在世界首位，人均占有量高于世界平均水平[1].但隨著集約化養(yǎng)殖方式的大規(guī)模應(yīng)用，產(chǎn)量提高的同時也導(dǎo)致了病害的頻繁爆發(fā).同時，由于我國水產(chǎn)疫苗研究起步較晚，只有較少種類的疫苗可供使用[2].鑒于此，我國水產(chǎn)病害的防治主要以預(yù)防為主，快速、準(zhǔn)確和簡單的檢測方法對于及時找出病原體顯得尤為重要.因為只有找出真正的病原，才能對癥下藥，在疾病發(fā)生時盡量將損失減小到最低.然而傳統(tǒng)的檢測方法(選擇性培養(yǎng)基和生理生化試驗檢測)，盡管也能檢測出病原體，但費力、費時和低靈敏度等缺點使得其不適合于當(dāng)前水產(chǎn)病原體的疫情防控.如致病性嗜水氣單胞菌的國標(biāo)檢測方法是經(jīng)過一系列的生理生化試驗鑒定，其檢測周期長，操作十分復(fù)雜[3].

分子生物學(xué)檢測方法在靈敏度、特異性和檢測時間等方面都優(yōu)于傳統(tǒng)病原體檢測方法.核酸擴增在分子生物學(xué)檢測中是常用的手段，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是目前使用最頻繁的核酸擴增技術(shù).然而對精密溫控儀器的依賴限制了其在條件較差的實驗室及基層漁場的使用，尤其不適合現(xiàn)場快速檢測.而核酸等溫擴增技術(shù)不需要精密的溫控循環(huán)設(shè)備,在一個特定的溫度下通過添加不同性質(zhì)的酶和特異性引物即可快速完成核酸的擴增，極大地降低了對設(shè)備的要求，縮短了反應(yīng)時間，近年來正蓬勃發(fā)展.

筆者通過對近十年來相關(guān)文獻(xiàn)的整理發(fā)現(xiàn)：無論是從核酸等溫擴增技術(shù)的開發(fā)上，還是其在病原體的檢測應(yīng)用上，大多數(shù)都是由國外研究者開展的，而國內(nèi)研究者在這方面涉足較少.本文對目前常見核酸等溫擴增技術(shù)的原理和優(yōu)缺點等方面做了比較，并對它們在水產(chǎn)病原體的檢測應(yīng)用上做了系統(tǒng)的綜述，希望能夠幫助國內(nèi)讀者快速了解核酸等溫擴增技術(shù)，促進(jìn)該技術(shù)在水產(chǎn)病原體快速檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用.

1 常見的核酸等溫擴增技術(shù)及比較

目前常見的等溫擴增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、依賴解旋酶等溫擴增(helicase-dependent isothermal amplification, HDA)、依賴核酸序列等溫擴增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、鏈替代等溫擴增(strand displacement amplification, SDA)、交叉引物等溫擴增(crossing priming amplification, CPA)、滾環(huán)等溫擴增(rolling circle amplification, RCA)和重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification, RPA)等[4].

1.1 LAMP

LAMP技術(shù)于2000年由日本Eiken公司發(fā)明[5].其原理是：根據(jù)目的基因的6個區(qū)域設(shè)計4條不同的引物(內(nèi)引物和外引物)，通過在反應(yīng)體系中添加具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶、反應(yīng)模板和基質(zhì)等，在一定溫度(60～65 ℃)下不斷地進(jìn)行DNA合成，從而達(dá)到目的基因快速擴增的目的，可在15～60 min實現(xiàn)109～1 010倍的擴增.

LAMP技術(shù)具有對設(shè)備要求低、操作簡單、靈敏度高和特異性強等優(yōu)點.因其有著高度的特異性，因此只需根據(jù)擴增反應(yīng)產(chǎn)物的有無即可對靶基因序列的存在與否作出判斷.LAMP的缺點也是比較明顯，如需要設(shè)計多對引物，使得引物設(shè)計較為復(fù)雜；其次是在對常規(guī)LAMP擴增產(chǎn)物的檢測時，需要打開蓋子，容易形成氣溶膠，造成假陽性[6].

1.2 HDA

HDA是美國的研究者在2004年發(fā)明的一種等溫擴增技術(shù)，其擴增原理類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制.主要原理如下：首先，通過解旋酶在恒等溫的條件下使得DNA雙鏈打開，隨即單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)結(jié)合到DNA單鏈上，抑制單鏈DNA重新形成雙鏈DNA，在體系中提供了能夠與引物互補結(jié)合的單鏈DNA模板，在DNA聚合酶催化下進(jìn)行延伸(圖1).剛剛合成的雙鏈DNA隨即又進(jìn)入新的循環(huán)，結(jié)果使得目的基因呈指數(shù)式增長[7].

圖片來源于文獻(xiàn)[6].A：解旋酶解開DNA雙鏈；B：引物與單鏈DNA結(jié)合；C：DNA 聚合酶在引物基礎(chǔ)上延伸，兩條子鏈擴增形成；D：新的循環(huán)開始.圖1 HDA反應(yīng)原理Fig.1 The principle of HDA reaction

相較于傳統(tǒng)的PCR擴增，HDA在于加入了解旋酶和單鏈結(jié)合蛋白，且整個擴增過程是在一個溫度條件下進(jìn)行的，避免了PCR擴增過程中通過溫控儀來控制反應(yīng)的進(jìn)行.目前，研究者通過在體系中添加逆轉(zhuǎn)錄酶等，HDA也已經(jīng)成功應(yīng)用于RNA模板的擴增[8].HDA技術(shù)原理和對設(shè)備要求均簡單，只需要恒溫器即可，無需復(fù)雜引物.

1.3 NASBA

NASBA技術(shù)是在PCR擴增技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸擴增技術(shù).NASBA是在等溫條件下通過3種酶來控制反應(yīng)，分別是來自禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、來自大腸桿菌的核糖核酸酶(RNaseH)和來自噬菌體的T7RNA聚合酶[9].其原理是：整個擴增過程包括非循環(huán)相和循環(huán)相.在非循環(huán)相擴增過程中，反向引物在模板RNA上掃描與之互補的序列，隨之反向引物與其特異性結(jié)合，在AMV的催化作用下合成互補的cDNA鏈，形成了RNA-DNA雜合體.隨即RNAaseH特異地將RNA-DNA雜合體中的RNA鏈降解掉，帶有啟動子序列的正向引物與單鏈cDNA結(jié)合，合成雙鏈DNA.由于新合成的雙鏈DNA帶有可以被T7RNA聚合酶特異地識別的啟動子序列，由此進(jìn)入循環(huán)相擴增，高效、特異地合成反義RNA(圖2).

由于雙鏈DNA中T7啟動子序列的加入，而外來DNA不具有這樣的結(jié)構(gòu)，因此，NASBA不易受到污染，使得其特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通PCR擴增技術(shù)[10].

圖片來源于文獻(xiàn)[11].A：反向引物在RNA模板掃描與之互補的序列；B：反向引物與模板特異性結(jié)合；C：RNA-DNA雜合體形成；D：RNA-DNA雜合體中的RNA鏈被降解；E：帶有啟動子序列的正向引物與單鏈DNA結(jié)合；F：互補鏈DNA延伸，帶有T7啟動子序列的DNA雙鏈形成，以此為模板合成正向RNA；M、L、G、K、H、J、I：循環(huán)相步驟.圖2 NASBA反應(yīng)原理Fig.2 The principle of NASBA reaction

1.4 SDA

Walker et al[12]于1992年開發(fā)了SDA.其主要原理是：首先，通過引物與單鏈DNA進(jìn)行特異地識別，在具有鏈置換活性的聚合酶催化下合成具有HincⅡ酶識別位點的目的DNA序列，由此進(jìn)行SDA循環(huán)擴增.通過HincⅡ酶切割具有識別位點的目的DNA序列，通過聚合酶在切割處對3′端進(jìn)行延伸擴增，互補鏈則被替換；新合成的替代鏈作為新的模板，體系中通過循環(huán)進(jìn)行這些步驟，達(dá)到目的DNA序列快速擴增的目的.

SDA雖然具有擴增效率高和特異強的優(yōu)點，但也有缺點，如反應(yīng)成本較高，且由于產(chǎn)物中存在單、雙鏈DNA產(chǎn)物，因此電泳時拖尾現(xiàn)象較明顯.

1.5 CPA

CPA由杭州優(yōu)思達(dá)公司完全獨立研發(fā)，是目前我國首個具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸等溫擴增技術(shù)[13].該技術(shù)無需預(yù)變性步驟或者通過切口酶打開雙鏈，在恒溫63 ℃下引物與模板結(jié)合成混合物，反應(yīng)產(chǎn)物中通過自發(fā)形成的泡狀結(jié)構(gòu)，交叉引物與5′端的結(jié)合可激發(fā)鏈置換反應(yīng)的進(jìn)行[14].CPA技術(shù)具有高靈敏度、高特異性和操作簡便的優(yōu)點.但該反應(yīng)體系復(fù)雜、方法不穩(wěn)定和假陽性現(xiàn)象等缺點也限制了該技術(shù)的使用[4].

1.6 RCA

RCA技術(shù)于1998年建立的一種核酸等溫擴增技術(shù)，擴增原理類似于CPA技術(shù)[15].目前主流的指數(shù)RCA的主要原理是：首先，正向引物結(jié)合到環(huán)狀DNA序列上，在聚合酶作用下繼續(xù)延伸，產(chǎn)生帶有反向引物的結(jié)合位點的單鏈DNA，隨即反向引物結(jié)合到單鏈DNA并進(jìn)行延伸，產(chǎn)生的子代單鏈DNA充當(dāng)模板，進(jìn)行新的擴增(圖3).擴增的結(jié)果是產(chǎn)生許多長短不一的雙鏈DNA產(chǎn)物，擴增效率大大提高.雖然RCA技術(shù)具有高靈敏度和高效的擴增技術(shù)，但也存在著鎖式探針連接效率、背景信號干擾和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)制約等問題[16].

圖片來源于文獻(xiàn)[6].A：正向引物結(jié)合到環(huán)狀DNA序列上并進(jìn)行延伸；B：繼續(xù)擴增，產(chǎn)生帶有反向引物的結(jié)合位點的單鏈DNA;C：反向引物結(jié)合到單鏈DNA并進(jìn)行延伸；D：產(chǎn)生的子代單鏈DNA充當(dāng)模板，進(jìn)行新的擴增.圖3 指數(shù)RCA擴增原理Fig.3 The principle of hyperbranched RCA reaction

1.7 RPA

RPA技術(shù)是被稱為有望替代PCR技術(shù)的核酸擴增技術(shù)，是由英國TwistDx公司開發(fā)的核酸等溫擴增產(chǎn)品.該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，一個簡單水浴鍋即可[17].它的原理是：在恒溫(37～42 ℃)條件下，重組酶與引物結(jié)合形成聚合物，能夠在模板鏈無需熱變性的情況下與引物同源序列結(jié)合，通過鏈置換反應(yīng)形成一個“D”字型環(huán)；在聚合酶催化下進(jìn)行延伸，子鏈分離并繼續(xù)延伸，對DNA序列進(jìn)行指數(shù)式擴增(圖4).

RPA技術(shù)的關(guān)鍵和難點在于前期引物和探針的設(shè)計，大多數(shù)PCR引物都不適合，且目前沒有專門的引物設(shè)計軟件，需要研究者親自摸索.其擴增產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，操作步驟類似于普通PCR產(chǎn)物的檢測；也可以通過將RPA技術(shù)與橫向流動試紙條(lateral flow dipstick, LFD)技術(shù)結(jié)合起來，通過試紙條檢測反應(yīng)產(chǎn)物；還可以在反應(yīng)體系中加入探針，構(gòu)建實時監(jiān)測反應(yīng)情況的實時熒光RPA.

盡管核酸等溫擴增技術(shù)一般只需要在恒定溫度下就可以完成擴增，但各種核酸等溫擴增所需要的溫度不同，以及它們擴增需要的引物數(shù)量、酶的種類和擴增時間等方面各不相同，筆者通過對相關(guān)文獻(xiàn)的閱讀并結(jié)合本課題組的科研經(jīng)歷，在表1系統(tǒng)地列舉了各種常見的核酸等溫擴增技術(shù)所需引物數(shù)量、溫度、時間及優(yōu)缺點.

圖片來源于文獻(xiàn)[18].A：重組酶與引物結(jié)合形成復(fù)合物，并與同源靶序列結(jié)合；B：通過鏈置換形成一個“D”字型環(huán)；C：聚合酶促使引物延伸；D：子鏈分離，并繼續(xù)延伸；E：子鏈形成.圖4 RPA反應(yīng)原理Fig.4 The principle of RPA reaction

技術(shù)引物/條溫度/℃時間/min優(yōu)點缺點LAMP460～6560特異性強,擴增效率高引物設(shè)計復(fù)雜HDA260～65120擴增效率高,引物設(shè)計簡單 需要復(fù)雜的反應(yīng)體系優(yōu)化過程NASBA237～4290～120檢測速度快,有商業(yè)試劑盒可以使用不適用于DNA的擴增SDA437120效率高主要適用于短片段的擴增CPA46370操作簡便反應(yīng)體系復(fù)雜 RCA13760適合于單鏈DNA的擴增成本高RPA225～4220引物設(shè)計簡單,特異性高對反應(yīng)條件要求高

2 在水產(chǎn)病原體快速檢測上的應(yīng)用現(xiàn)狀

通過對PubMed數(shù)據(jù)庫中近十年來核酸等溫擴增技術(shù)在水產(chǎn)病原體檢測上應(yīng)用文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)：各種核酸等溫擴增技術(shù)在水產(chǎn)病原體檢測上的應(yīng)用頻次差別較大；各種核酸等溫擴增技術(shù)的檢測限和檢測時間也各不相同；在細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原體的檢測上均有應(yīng)用.表2列舉了各種常見核酸等溫擴增技術(shù)近十年來的具體應(yīng)用情況.

2.1 在細(xì)菌快速檢測上的應(yīng)用

LAMP技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性水產(chǎn)病原體的檢測上，在多種致病性弧菌和鏈球菌等的檢測上都已成功應(yīng)用(表2).王耀煥等[19]建立了創(chuàng)傷弧菌的LAMP快速檢測方法，能在1 h內(nèi)高效特異地檢出創(chuàng)傷弧菌，通過將LAMP技術(shù)與LFD技術(shù)結(jié)合起來，建立了創(chuàng)傷弧菌的LFD-LAMP檢測方法，能夠快速、靈敏、特異地檢測出創(chuàng)傷弧菌；Wang et al[20]建立了同時檢測創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的LAMP檢測方法，其靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，且可以在多種樣品中同時檢測出創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌；Suebsing et al[21]根據(jù)無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的sodA基因設(shè)計引物，建立了羅非魚鏈球菌病的LAMP檢測方法，其靈敏度是巢穴PCR的10倍，結(jié)果可以直接通過觀察顏色變化讀取.

表2 近十年等溫擴增技術(shù)在水產(chǎn)病原體快速檢測中的應(yīng)用Table 2 The application of isothermal amplification in the rapid detection of aquatic pathogens in the past decade

HDA技術(shù)目前僅在霍亂弧菌、副溶血性弧菌和鰻弧菌等水產(chǎn)病原體的檢測上有應(yīng)用.Tong et al[73]將HDA技術(shù)與TaqMan探針結(jié)合起來，建立了高效、快速的檢測霍亂弧菌的方法.石琰璟等[61]根據(jù)副溶血性弧菌的tlh基因保守區(qū)設(shè)計引物,構(gòu)建了等溫條件下快速、特異地檢測副溶血性弧菌的HDA檢測方法，且特異性良好，檢測限達(dá)到19.9 ng，其靈敏度與普通PCR相當(dāng).梁君妮等[60]根據(jù)鰻弧菌的toxR基因設(shè)計特異引物，通過對反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化，成功構(gòu)建了基于HDA的鰻弧菌快速檢測方法.該方法能夠特異地檢出魚類鰻弧菌，不會與其他魚類病原體產(chǎn)生交叉反應(yīng)；其檢測限達(dá)到30 ng，使用構(gòu)建的方法對人工污染樣品的檢測限為2.1×102CFU，通過HDA對120份實際樣品進(jìn)行檢測，與對比PCR檢測技術(shù)的符合率為100%，陽性檢出率優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法.

秦勝利等[62]根據(jù)溶藻弧菌的hsp60基因為目的序列設(shè)計引物，構(gòu)建了溶藻弧菌的NASBA快速檢測體系.結(jié)果表明：該方法能特異地檢測出6.9×102CFU溶藻弧菌DNA，靈敏度比普通PCR方法高.倪鑫等[63]根據(jù)副溶血性弧菌的tlh基因為靶基因設(shè)計引物和探針，建立的NASBA檢測方法對副溶血性弧菌的檢測限為5.1×102CFU，且與其他病原菌不會產(chǎn)生交叉反應(yīng).相比Wang et al[20]建立的LAMP檢測副溶血性弧菌方法和石琰璟等[61]建立的HDA 檢測副溶血性弧菌方法，LAMP檢測方法的檢測限和檢測時間明顯優(yōu)于其他兩種方法.

2.2 在病毒快速檢測上的應(yīng)用

LAMP技術(shù)在水產(chǎn)病毒病原體的檢測上應(yīng)用廣泛，尤其在蝦類病毒的檢測上.如李紅梅等[74]研究構(gòu)建了對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)的LAMP檢測方法.結(jié)果表明：建立的LAMP檢測方法在63 ℃條件下，能夠在30 min內(nèi)檢測出106倍稀釋的IHHNV基因組DNA，與27種水生動物及對蝦常見病原的DNA均無交叉反應(yīng).

CPA技術(shù)在水產(chǎn)病原體的檢測上已有報道.趙小金等[65]依據(jù)牡蠣皰疹病毒魁蚶株(OsHV-1-SB)全基因組序列保守區(qū)設(shè)計引物，建立了CPA檢測體系，并對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化.結(jié)果表明：該方法能夠特異地檢測出30拷貝的質(zhì)粒DNA,使用建立的方法在對22份實際樣品的檢測中顯示，該方法簡單、迅速、特異性強.粟子丹[66]建立的赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒的CPA聯(lián)合切向流試紙條檢測方法(CPA-LFD)簡單、快速，該方法能夠特異地檢測出10拷貝 RNA模板,比RT-PCR的檢測限還要高出10倍，與常見的魚類病毒性病原體均不會出現(xiàn)交叉反應(yīng).楊昊霖[67]根據(jù)對蝦白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的基因組保守區(qū)設(shè)計引物構(gòu)建了CPA檢測方法，并將該方法與WSSV的其他核酸擴增檢測方法進(jìn)行了比較.結(jié)果顯示，構(gòu)建的CPA檢測方法對WSSV的檢測限為10拷貝，靈敏度高于普通PCR檢測方法，與qPCR和LAMP方法有著相同的靈敏度，與其他常見的蝦類病毒IHHNV、HPV和副溶血性弧菌均沒有交叉反應(yīng).

2.3 在寄生蟲快速檢測上的應(yīng)用

核酸等溫擴增技術(shù)在寄生蟲的檢測上亦有少量應(yīng)用.Cai et al[23]利用LAMP技術(shù)檢測魚的肝臟吸蟲——中華肝吸蟲，根據(jù)組織蛋白酶B3基因序列設(shè)計引物，建立的LAMP檢測技術(shù)的靈敏度是傳統(tǒng)PCR技術(shù)的100倍.余傳信等[75]和Kumagai et al[24]分別建立了日本血吸蟲感染性釘螺的LAMP檢測方法，能夠在65 min內(nèi)分別檢測出100 fg和1 pg血吸蟲DNA.余傳信等[75]將建立的LAMP檢測技術(shù)在30只感染性釘螺實際樣品的檢測中發(fā)現(xiàn)，LAMP的陽性檢出率為93.33%，敏感性高于傳統(tǒng)PCR的陽性檢測率(83.33%).

3 存在問題及展望

3.1 在水產(chǎn)病原體快速檢測上存在的問題

通過對PubMed數(shù)據(jù)庫近十年來的相關(guān)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)：眾多核酸等溫擴增技術(shù)在水產(chǎn)病原體快速檢測上應(yīng)用最多、最成熟的是LAMP技術(shù)(41篇)，在細(xì)菌、病毒和寄生蟲的檢測上都有應(yīng)用，而其他等溫擴增技術(shù)在水產(chǎn)病原體的檢測上應(yīng)用較少或至今仍沒有應(yīng)用.而PCR這一經(jīng)典核酸擴增技術(shù)盡管需要依賴于精密儀器且存在一些其他方面的不足，但毋庸置疑仍是目前體外核酸擴增應(yīng)用最為成熟和廣泛的技術(shù).在國內(nèi)外有多種依據(jù)PCR技術(shù)開發(fā)的商業(yè)試劑盒可供水產(chǎn)病原體的檢測使用，而對比核酸等溫擴增技術(shù)，盡管也有相關(guān)文獻(xiàn)報道，但大多數(shù)還是處于實驗室研究階段，僅LAMP和NASBA檢測方法在致病菌檢測上有相關(guān)少量的試劑盒可供使用,并建立了相應(yīng)的進(jìn)出口檢驗檢疫標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 2754和GB/T 19439—2004)；但其他大多數(shù)重要的水產(chǎn)病原體卻未能建立核酸等溫檢測方法，可供使用的具有商業(yè)價值的水產(chǎn)病原體的試劑盒較少，核酸等溫擴增技術(shù)的相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)也不完善，這些都限制了等溫擴增技術(shù)的使用和推廣.

3.2 展望

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，催生了各種核酸擴增技術(shù)，但任何病原體檢測方法的研發(fā)，都要以實際應(yīng)用為最終目的.核酸等溫擴增技術(shù)具有對設(shè)備要求簡單、操作方便、在等溫條件下即可迅速完成反應(yīng)等優(yōu)點，受到國內(nèi)外研究者的重視.然而，核酸等溫擴增技術(shù)要想真正做到適應(yīng)于現(xiàn)場快速檢測，筆者認(rèn)為以下幾個方面將是未來研發(fā)的重點.

3.2.1 開發(fā)專門的引物設(shè)計軟件 目前，各種核酸等溫擴增技術(shù)除了LAMP技術(shù)具有專門適用的引物設(shè)計軟件外，其他技術(shù)均沒有專用的引物設(shè)計軟件供研究者使用，研究者往往是先根據(jù)PCR引物設(shè)計軟件預(yù)評估設(shè)計引物的優(yōu)劣，再進(jìn)行實驗篩選.根據(jù)本課題組的經(jīng)驗得知，PCR技術(shù)軟件評出的結(jié)果與實際實驗結(jié)果往往有很大的區(qū)別，這樣就大大增加了引物設(shè)計的工作量和成本.因此根據(jù)各種核酸等溫擴增技術(shù)開發(fā)出不同的引物設(shè)計軟件，對于不同核酸等溫擴增技術(shù)的推廣是至關(guān)重要的一步，它的完善必將推動核酸等溫擴增技術(shù)的跨越式發(fā)展.

3.2.2 研發(fā)重要水產(chǎn)病原體的商業(yè)試劑盒 目前，核酸等溫擴增技術(shù)雖然在水產(chǎn)病原體的檢測上有文獻(xiàn)報道(表2)，但大多數(shù)重要的水產(chǎn)病原體還未有專門的商業(yè)試劑盒可供非專業(yè)的基層養(yǎng)殖場從業(yè)人員使用.因此，基于各種核酸等溫擴增技術(shù)的擴增效率高、特異性強和靈敏度高等特點，開發(fā)出針對各種重要水產(chǎn)病原體的快速診斷試劑盒對于水產(chǎn)疾病的防控有重要的意義.

3.2.3 結(jié)合不同技術(shù) 各種核酸等溫擴增技術(shù)盡管有諸多優(yōu)點，但還存在各自的缺點，研究者需要將不同技術(shù)結(jié)合起來使用[76-78]，克服技術(shù)本身的缺點，使得結(jié)果讀取更為方便和快捷.如將LFD技術(shù)與RPA技術(shù)結(jié)合起來，使得反應(yīng)結(jié)果通過試紙條顏色變化即可讀取，擺脫了對儀器的依賴，同時也不需要操作人有專業(yè)背景，特別適合我國基層養(yǎng)殖場使用.

本世紀(jì)以來，迅速發(fā)展的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)滿足了人類對蛋白質(zhì)的需求.快速、簡便和靈敏的核酸等溫檢測技術(shù)非常適用于現(xiàn)場快速檢測及基層養(yǎng)殖場普及應(yīng)用.核酸等溫檢測技術(shù)的不斷完善、新的試劑盒出現(xiàn)以及與其他新技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，將極大地推動水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展.