貽貝粘蛋白中多巴氧化還原狀態(tài)表征方法研究

【作 者】柯林楠，湯京龍，宋茂謙，高敏，陸云龍，趙帥旗，閉靜秀，何利中，母瑞紅

1 中國(guó)食品藥品檢定研究院(醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)管理中心，CFDA)，北京市，102629 2 江陰貝瑞森生化技術(shù)有限公司，江陰市，214437

0 引言

貽貝粘蛋白（Mussel Adhesive Protein，MAP）是從紫貽貝（Mytilusedulis）的足絲腺中提取純化的一種蛋白質(zhì)。由于MAP具有優(yōu)良的粘附特性、生物相容性及生物可降解性[1-2]，其在醫(yī)療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，可作為生物粘合劑，用于修復(fù)斷裂骨骼、皮膚創(chuàng)傷等[3-5]。MAP中含有大量的3, 4-二羥基苯丙氨酸 （即多巴Dopa）。Dopa是一類(lèi)鄰羥基酚類(lèi)衍生物，特殊的結(jié)構(gòu)使得它呈現(xiàn)出多樣的化學(xué)反應(yīng)性，可以通過(guò)非共價(jià)健和共價(jià)鍵與多種基材表面鍵合，形成很強(qiáng)的粘附力[6-9]。同時(shí)研究者還發(fā)現(xiàn)Dopa的氧化還原態(tài)對(duì)MAP粘附性能也有很大影響，還原態(tài)的多巴與無(wú)機(jī)表面有很強(qiáng)的鍵合力。設(shè)計(jì)原位固化材料和粘附生物底物時(shí)需要氧化態(tài)的多巴醌[10]。因此，Dopa氧化還原狀態(tài)的研究對(duì)于MAP粘合劑在臨床上成功應(yīng)用，以及產(chǎn)品的質(zhì)量控制都是非常必要的。本文對(duì)MAP的氧化還原態(tài)進(jìn)行了研究，探討HPLC法對(duì)MAP的氧化還原態(tài)表征的可行性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀，島津LC-15C；紫外分光光度儀，島津UV-2401PC；ACO-001電磁式空氣泵，森森集團(tuán)股份有限公司。

1.2 試劑

1 mmol/L DOPA標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密稱(chēng)取L-DOPA標(biāo)準(zhǔn)品197.2 mg，至1 L容量瓶中，加1 mL濃鹽酸溶解，加蒸餾水定容至1 L。

考馬斯亮藍(lán)G-250試劑：取0.1 g考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL質(zhì)量濃度為0.85 g/mL的磷酸，作為母液保存，使用時(shí)用水稀釋到1 000 mL。

酸試劑：取4.3 mL濃鹽酸，加95.7 mL蒸餾水，搖勻。

堿試劑： 取4 g氫氧化鈉，加蒸餾水溶解，并稀釋至100 mL。

亞硝酸試劑：1.45 mol/L 亞硝酸鈉溶液和0.41 mol/L 鉬酸鈉溶液；取亞硝酸鈉10 g與鉬酸鈉10 g，加水稀釋至100 mL。

2 樣品制備

2.1 不同年份生產(chǎn)的樣品留樣

分別取2012年到2016年間MAP原液（江蘇省江陰貝瑞森生化技術(shù)有限公司），在潔凈工作臺(tái)上用含有0.005%乙酸的生理鹽水溶液將樣品蛋白質(zhì)含量稀釋至0.5 mg/mL，作為供試液。

2.2 加速氧化試驗(yàn)樣品

取“2.1”節(jié)中2016年的供試液，用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0，隨后移取50 mL至250 mL的滅菌燒瓶中。將燒瓶置于37 ℃水浴中，用空氣泵充氣，氣流速度為6 L/min，空氣引入MAP溶液之前先通過(guò)裝有水的瓶子。每24 h從燒瓶中取出5 mL作為供試液，共進(jìn)行6天。

3 方法

3.1 MAP高效液相色譜(HPLC)分析

分別取“2.1”“2.2” 節(jié)中的供試液進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜條件為色譜柱：Agilent Zobax SB 300A C8（4.6×250 mm）；流動(dòng)相A： 0.1%三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0 min～8 min，5%～12% B；8.01 min～20 min，15% B；20.01 min～45 min，15%～100% B；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.9 mL/min。

3.2 MAP中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[11]測(cè)定MAP中蛋白質(zhì)含量，測(cè)定波長(zhǎng)595 nm。

3.3 MAP中多巴含量測(cè)定

MAP中多巴含量采用改良的Arnow方法測(cè)定[12]，測(cè)定波長(zhǎng)為500 nm。

4 結(jié)果與討論

4.1 不同年份生產(chǎn)的樣品留樣測(cè)定結(jié)果

取“2.2” 節(jié)中制備的供試液進(jìn)行高效液相色譜測(cè)試，色譜圖見(jiàn)圖1。

結(jié)果表明，隨著存儲(chǔ)時(shí)間的增加，樣品主峰的保留時(shí)間從30 min向29 min偏移，2016年的樣品主峰保留時(shí)間為30.24 min，2012年為29.05 min。保留時(shí)間在30 min左右的主峰峰面積在變小，29 min的峰面積在增大。分析原因可能是隨著存放時(shí)間，貽貝粘蛋白中的多巴基團(tuán)會(huì)有部分被空氣中的氧氣自然氧化，還原態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變成氧化態(tài)，保留時(shí)間發(fā)生變化。

圖1 不同生產(chǎn)時(shí)間的半成品樣品的色譜圖Fig.1 Chromotograms of the diあerent retained samples

4.2 加速氧化樣品試驗(yàn)結(jié)果

表1為加速氧化樣品的多巴濃度和蛋白含量測(cè)試結(jié)果。結(jié)果顯示：樣品中多巴濃度隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)而減少，蛋白質(zhì)含量基本保持恒定。

表1 暴露在空氣中不同時(shí)間的樣品中蛋白含量和多巴含量測(cè)試結(jié)果Tab.1 Determination of protein and dopa for samples in accelerated oxidation time

改良的Arnow方法測(cè)定多巴含量的原理如圖2[12]所示。MAP中的多巴首先在酸性環(huán)境下，與亞硝酸鈉反應(yīng)，然后，堿試劑與多巴的兩個(gè)酚羥基反應(yīng)，生成紅色的醌類(lèi)化合物，根據(jù)顯色程度測(cè)定MAP中多巴的含量，其特點(diǎn)是對(duì)鄰苯二酚基團(tuán)具有很強(qiáng)的特異性[13-14]。該法用于MAP中多巴含量測(cè)定時(shí)，不需要對(duì)樣品水解前處理。加速氧化樣品隨著在空氣中暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，多巴逐漸氧化成多巴醌，無(wú)法參與圖2所示的反應(yīng)，多巴含量下降。

圖2 多巴比色法檢測(cè)原理Fig.2 Schematic representation of colorimetric method for Dopa

圖3 為加速氧化樣品的色譜圖，結(jié)果表明樣品加速氧化的時(shí)間越長(zhǎng)，主峰保留時(shí)間偏移越明顯。與圖1結(jié)果基本一致。結(jié)合比色法測(cè)定多巴含量的結(jié)果可以看出，MAP色譜峰保留時(shí)間的偏移與多巴的氧化-還原態(tài)有關(guān)。

圖3 加速氧化樣品的色譜圖Fig.3 Chromotogram of samples in accelerated oxidation

5 結(jié)論

貽貝粘蛋白中的多巴基團(tuán)對(duì)于其功能的實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要，多巴及其氧化產(chǎn)物對(duì)于貽貝粘蛋白的粘附、交聯(lián)成膜以及促愈合功能的實(shí)現(xiàn)是不可或缺的。因此，貽貝粘蛋白氧化還原狀態(tài)評(píng)價(jià)是MAP質(zhì)量控制的關(guān)鍵性步驟，MAP氧化還原狀態(tài)的量化表征也是至關(guān)重要的。本文首次采用HPLC法對(duì)MAP氧化還原狀態(tài)進(jìn)行了研究，結(jié)合比色測(cè)定多巴含量的結(jié)果后發(fā)現(xiàn)MAP色譜峰的保留時(shí)間變化與MAP氧化還原狀態(tài)存在相關(guān)性，可以通過(guò)特征吸收峰的變化鑒別貽貝粘蛋白的氧化還原狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于貽貝粘蛋白醫(yī)療產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、產(chǎn)品改性以及產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供方法有重要的指導(dǎo)意義。