硝苯地平在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)

胡 楠，王 欣，魯曉雨，趙 娣，王莉英，鄒素蘭

(1. 常州市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 常州 213003；2. 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；3. 中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211198)

硝苯地平是二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，臨床廣泛用于高血壓和心絞痛的治療，對心血管疾病臨床癥狀的改善發(fā)揮重要作用。硝苯地平口服吸收迅速完全，血漿蛋白結(jié)合率高(90%左右)，在體內(nèi)主要由肝臟CYP3A4代謝，80%經(jīng)腎排泄，20%經(jīng)糞便排出。硝苯地平血藥濃度與藥理作用相關(guān)，對于高血壓患者，其理想治療濃度為10～100 μg·L-1[1]，血藥濃度波動易引起其降壓效果改變及不良反應(yīng)的發(fā)生。

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，很多生理生化指標(biāo)與蛋白功能發(fā)生改變，從而影響藥物的吸收、分布、代謝、排泄過程，導(dǎo)致一些藥物在糖尿病患者和糖尿病動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)發(fā)生改變[2]。然而，尚未有研究報道硝苯地平在糖尿病狀態(tài)下的藥代動力學(xué)特征，因此，本研究比較正常及糖尿病狀態(tài)下大鼠體內(nèi)硝苯地平的藥代動力學(xué)差異。

1 材料

1.1實驗動物SD大鼠，♂，體質(zhì)量(170±10)g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK(浙)2014-0001。

1.2藥物與試劑硝苯地平對照品(批號：100338-0001)、內(nèi)標(biāo)地西泮對照品(批號：171225-200302)，均購于中國食品藥品檢定研究院；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，購于美國Sigma公司；一水檸檬酸(99.5%，批號：H1624005)、二水檸檬酸鈉(≥99.0%，批號：C1624081)，購于中國阿拉丁公司； 抗CYP3A1抗體(貨號：ab22724)，購于英國Abcam公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司； SYBRGreen realtime PCR master mix plus QPK212試劑盒，購自日本TOYOBO公司。

1.3儀器API4000三重四級桿檢測器、操作軟件Analyst 1.5.1(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品)；高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司產(chǎn)品)；低溫超速離心機5430R(德國Eppendorf公司產(chǎn)品)；Vortex-Genie2渦旋震蕩儀(美國Scientific Industries公司產(chǎn)品)；StepOnePlus熒光定量PCR儀(美國ABI公司產(chǎn)品)。

2 方法

2.1糖尿病大鼠模型的建立大鼠隨機分為糖尿病模型組及正常對照組。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，禁食不禁水12 h，模型組大鼠腹腔注射STZ 65 mg·kg-1，對照組大鼠注射溶媒(0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.5)。3 d后測定大鼠空腹血糖，空腹血糖高于11.1 mmol·L-1的大鼠選入糖尿病模型組。在造模后的35 d進(jìn)行實驗。

2.2生化指標(biāo)的檢測全自動生化分析儀檢測血清葡萄糖(glucose，GLU)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平[3]。

2.3糖尿病大鼠灌胃硝苯地平后的藥代動力學(xué)研究造模35 d后的模型組和對照組大鼠，按10 mg·kg-1體質(zhì)量灌胃給予硝苯地平(硝苯地平用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成1 g·L-1的混懸液，給藥體積為10 mL·kg-1)，于給藥前和給藥后15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、4 h、8 h、12 h，眼底靜脈叢取血0.3 mL，置肝素處理的EP管中，離心10 min，取血漿，-80 ℃保存待測。

2.4大鼠血漿中硝苯地平濃度的測定[4]

2.4.1樣本處理 精密吸取血漿樣品50 μL，置于1.5 mL EP管中，加入50 μL乙腈，再加入100 μL含500 μg·L-1內(nèi)標(biāo)(地西泮)的乙腈，渦旋振蕩5 min，于12 000 r·min-1離心10 min，取上清液10 μL進(jìn)樣分析，所用操作均在避光條件下進(jìn)行。

2.4.2HPLC-MS/MS測定方法 使用前期建立的HPLC-MS/MS方法檢測大鼠血漿中硝苯地平濃度[4]。色譜條件：島津 Shim-pack VP-ODS C18色譜柱(2.0 mm×150 mm，5 μm)；流動相A：0.1%甲酸-水，流動相B：純乙腈；流速：0.35 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。采用梯度洗脫：0～0.5 min，A ∶B=90 ∶10(V/V)，0.5～2.0 min，A ∶B=20 ∶80(V/V)，2.0～4.0 min，A ∶B=20 ∶80(V/V)，4.0～4.3 min，A ∶B=90 ∶10(V/V)，4.3～5.5 min，A ∶B=90 ∶10(V/V)。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測方式，噴霧電壓5500 V，離子源溫度450 ℃；氣簾氣為10 kPa；鞘氣20 kPa；輔助氣：20 kPa；硝苯地平和地西泮的去簇電壓(DP)分別為33、100 V；碰撞能量(CE)分別為11、40 eV。掃描方式為多級反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 347.2→315.3(硝苯地平)和m/z 285.3→154.2(內(nèi)標(biāo)地西泮)。硝苯地平在2～1 000 μg·L-1范圍內(nèi)線性良好，定量下限為2 μg·L-1。該方法精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)及穩(wěn)定性均滿足方法學(xué)要求。

2.5Real-timePCR法測定CYP3A1mRNA表達(dá)按TRIzol一步法提取大鼠肝組織的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，樣品保存在-80 ℃。PCR反應(yīng)體系參照熒光定量試劑盒說明書，以β-actin為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計算CYP3A1 mRNA的相對表達(dá)量變化倍數(shù)。CYP3A1 引物序列為上游：5′-TGAAAGAAGTGTTTGGTGCCTAC-3′，下游：5′-ACTACTGACAAGAACAACGGATC-3′;β-actin引物序列為上游：5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′，下游：5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。

2.6Westernblot測定CYP3A1蛋白表達(dá)大鼠肝組織(正常組和糖尿病組)均按照蛋白提取說明書提取總蛋白樣本。經(jīng)核酸定量儀測定后，100 ℃、 5 min變性。加入5×SDS上樣緩沖液，8% SDS-PAGE電泳80 V 50 min, 100 V 2.5 h轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。TBST清洗10 min×3次，加入CYP3A1一抗(1: 500稀釋) 37 ℃孵育2 h。TBST清洗10 min×3次，加入二抗(1 ∶2 000)孵育1.5 h，再用TBST清洗10 min×3次。蛋白用ECL顯影，于Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像分析儀中曝光。采用Quantity One圖像分析軟件分析結(jié)果，測得條帶的灰度值，計算目的條帶CYP3A1和內(nèi)參GAPDH的比值。

3 結(jié)果

3.1糖尿病大鼠生理生化指標(biāo)大鼠腹腔注射STZ造模35 d后，呈現(xiàn)非常明顯的糖尿病癥狀(Tab 1)：多飲、多食、多尿，體重明顯下降，而血糖明顯升高，是對照組的6.2倍(P<0.01)，表明糖尿病大鼠造模成功。此外，糖尿病大鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C水平均明顯增加，分別是正常大鼠的4.1倍(P<0.01)、13.1倍(P<0.01)、1.7倍(P<0.05)、8.3倍(P<0.05)。

Tab 1 Physiological and biochemical parameters of diabetic and control rats n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.2兩組大鼠灌胃硝苯地平后硝苯地平的血藥濃度-時間曲線糖尿病組和對照組大鼠分別給予硝苯地平(10 mg·kg-1)灌胃后，測定不同時間點血漿中硝苯地平的濃度，平均血藥濃度-時間曲線如Fig 1所示。糖尿病組大鼠硝苯地平各時間點的血藥濃度均低于對照組大鼠。

Fig 1 Plasma concentration-time curves of nifedipine after oral administration of nifedipine in diabetic and control group (n=6)

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of nifedipinein diabetic and control rats after oral administration

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.4兩組大鼠肝臟CYP3A1mRNA與蛋白表達(dá)水平如Fig 2、3所示，與對照組相比，糖尿病大鼠肝臟中CYP3A1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加，CYP3A1 mRNA表達(dá)水平是對照組的1.77倍(P<0.05)，CYP3A1蛋白表達(dá)水平是對照組的1.84倍(P<0.01)。

4 討論

大量研究表明，糖尿病以多種方式，如影響胃腸道轉(zhuǎn)運時間、水和電解質(zhì)平衡、血漿蛋白水平、組織血流速率、藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體等因素，導(dǎo)致藥物的吸收、分布、代謝、排泄過程發(fā)生改變，從而影響一些藥物的藥代動力學(xué)。

Fig 2 Effect of diabetes on CYP3A1 mRNA level in rat liver n=4 )

*P<0.05vscontrol group

Fig 3 Effect of diabetes on CYP3A1 protein expression in rat liver n=4)

**P<0.01vscontrol group

本研究結(jié)果表明，糖尿病對硝苯地平在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)有較大的影響，使硝苯地平藥物暴露量降低(Cmax、AUC明顯下降)。CYP3A是一種重要的CYP450酶系，它在肝臟和腸道中含量最為豐富，臨床上60%以上的藥物都由其代謝。硝苯地平在人體內(nèi)主要由CYP3A4代謝，在大鼠體內(nèi)主要由CYP3A1/2代謝。有文獻(xiàn)報道，糖尿病大鼠肝臟中藥物代謝酶的功能與表達(dá)發(fā)生明顯改變，其中CYP3A1/2的功能與表達(dá)與正常對照大鼠相比均明顯升高[5]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠肝臟中CYP3A1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加，這可能是導(dǎo)致硝苯地平在糖尿病大鼠體內(nèi)代謝增加，清除加快，暴露減少的原因之一。此外，硝苯地平也是外排轉(zhuǎn)運體P-gp的底物。P-gp在體內(nèi)多種組織中高度表達(dá)，如肝、腸道、腎臟、大腦等，可以將藥物逆濃度梯度從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外，因此對藥物的吸收和分布具有重要作用。有研究報道，糖尿病狀態(tài)下，大鼠P-gp的功能及表達(dá)呈組織特異性改變[6]?？赏茰y糖尿病狀態(tài)下，P-gp的改變也會影響硝苯地平在體內(nèi)吸收和分布。此外，硝苯地平在體內(nèi)主要經(jīng)腎排泄，糖尿病大鼠多飲、多尿可能也會對硝苯地平的排泄具有一定影響。糖尿病影響硝苯地平體內(nèi)代謝過程的多個環(huán)節(jié)，各種影響因素的疊加，最終導(dǎo)致硝苯地平的血藥濃度發(fā)生明顯變化。

有關(guān)硝苯地平在糖尿病患者體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究報道非常有限，近期1篇文獻(xiàn)研究了妊娠合并2型糖尿病、高血壓患者口服硝苯地平的藥代動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)在血糖得到控制的妊娠合并高血壓患者中，2型糖尿病對硝苯地平的藥代動力學(xué)沒有影響[7]。動物實驗和臨床實驗結(jié)果的不一致可能與糖尿病的種類、血糖是否控制、研究對象的種屬、性別等因素有關(guān)，還有待進(jìn)一步探索。

(致謝：本實驗在中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院臨床藥代動力學(xué)研究室完成，對本實驗的參與人員表示感謝。)