槲皮素和茶多酚對光動力療法損傷PC12細胞效應(yīng)的影響

王 釗，鄭立卿

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系, 河北 張家口 075000)

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種美國FDA批準的治療惡性腫瘤的新方法，起源于20世紀70年代，其原理是惡性腫瘤選擇性地攝入并潴留光敏劑，在特定波長光激發(fā)下，引發(fā)一系列光化學(xué)反應(yīng)，釋放出單態(tài)氧，殺死腫瘤組織，產(chǎn)生治療作用[1]。光敏劑是決定PDT療效的重要因素之一。癌光啉(代號：PSD-007)是由多種有活性血卟啉衍生物組成的混合物，如3，8-(1-甲氧乙基) -8(3) -乙?；?次卟啉Ⅸ(MVD)、3(8) -(1-甲氧乙基) -8 (3) -(1-羥乙基) -次卟啉 Ⅸ(MHD)、3， 8-二 (1-甲氧乙基) -次卟啉Ⅸ(DMD)、3 (8) -(1-羥乙基) -8 (3) -乙?；?次卟啉Ⅸ(HVD)、原卟啉Ⅸ(Pp)、血卟啉Ⅸ(HP)等[2]。與第1代光敏劑HpD相比，PSD-007具有避光時間短、單線態(tài)氧產(chǎn)率高、對腫瘤組織選擇性攝入率高、對正常組織毒性小、在人體正常組織內(nèi)代謝速度快等優(yōu)點，針對腫瘤治療有較好的療效，是國內(nèi)光敏劑研究的熱點。

氧化損傷是阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病重要的發(fā)病機制。具有清除氧自由基的中藥是治療神經(jīng)退行性疾病的熱點，抗氧化也是預(yù)防各種疾病的熱點。槲皮素(quercetin，Que)化學(xué)名為3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮，存在于許多植物的花、葉、果實中，其藥理作用廣泛，具有抗癌、抗炎、心血管系統(tǒng)保護等作用，尤其具有明顯的抗氧化和清除自由基的作用[3-4]。茶多酚(tea polyphenol, TP) 屬黃烷醇類，是從綠茶葉中提取的多酚類物質(zhì)，是茶葉的主要活性成份之一，主要包括4種成分：表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素[5]。TP除具有抗突變、降血壓、降血脂、防治心血管疾病、抗氧化、抗菌消炎等功效外，還具有抑制淋巴細胞增殖[6]、降低高尿酸血癥、抗氧化作用[7]、抗癌防癌等活性[8]。實驗表明TP可透過血腦屏障，清除自由基，提高Aβ?lián)p傷的神經(jīng)細胞的存活率，維持細胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整，保護腦細胞免受神經(jīng)毒素損傷[9]。抗氧化劑對PDT效應(yīng)的影響僅有少量報道，抗氧化劑對PDT效應(yīng)是否有影響尚有爭議。本研究利用PDT氧化損傷PC12細胞，在此基礎(chǔ)上研究槲皮素、茶多酚對PDT效應(yīng)的影響，以期為黃酮類和多酚類化合物在PDT臨床治療方面的研究和利用積累資料。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞 (PC12細胞，無分化)，購于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所細胞中心。槲皮素、茶多酚購自上海源葉生物科技有限公司(用DMSO溶劑配成儲備液)；PSD-007由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所激光醫(yī)學(xué)實驗室饋贈；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT購自美國Amresco公司；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器CO2細胞培養(yǎng)箱、Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Thermo公司)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Safire2酶標儀(美國TECAN公司)；3K30型高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器)。

1.3細胞培養(yǎng)PC12 細胞接種于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%小牛血清、50 kU·L-1青霉素、50 kU·L-1鏈霉素)，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次。待細胞呈對數(shù)期增長時用于實驗。

1.4MTT法檢測細胞存活率細胞以3×104/孔接種96孔板，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，37℃孵育4 h后，每孔加180 μL DMSO溶解甲臜藍紫色顆粒，震蕩混勻后，于570 nm測定各孔吸光度值(optical density，OD)。按下式計算細胞存活率：細胞存活率=(實驗組OD570/空白對照組OD570)×100%。

1.5槲皮素和茶多酚對PC12細胞毒性檢測待PC12細胞呈對數(shù)期增長時消化細胞，以每孔3×104細胞接種于96孔板中，每孔100 μL。次日棄培養(yǎng)基，200 μL PBS洗1次細胞后，分別加入槲皮素(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)、茶多酚(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)的無血清培養(yǎng)基100 μL。于37℃、5% CO2條件下孵育24 h。PC12細胞空白對照組，不加其他干預(yù)。每組4個復(fù)孔取平均值，MTT法檢測細胞存活率。

1.6PSD-007介導(dǎo)的PDT對PC12細胞的殺傷作用取對數(shù)生長期的PC12細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔3×104個細胞。24 h后，加入光敏劑PSD-007溶液(終濃度0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg·L-1)，每組4個復(fù)孔，避光孵育24 h測定暗毒性。孵育4 h后，換全培養(yǎng)基孵育2 h后，每孔給予630 nm激光照射，能量密度4.8 J/cm2(20 mW/cm2，4 min)。24 h后，MTT法檢測細胞存活率?？瞻讓φ战MPC12細胞不加其他干預(yù)，激光照射對照組僅以4.8 J/cm2激光照射。

1.7MTT法檢測槲皮素和茶多酚對PSD-007介導(dǎo)的PDT效應(yīng)的影響對數(shù)生長期的PC12細胞接種于96孔板中。實驗分為5組：空白對照組、PSD-007組(10 mg·L-1)、LASER組(激光照射4.8 J/cm2)、PDT損傷組(10 mg·L-1PSD-007，4.8 J/cm2)、槲皮素處理組(12.5、25、50 μmol·L-1)、茶多酚處理組(12.5、25、50 μmol·L-1)，每組4個復(fù)孔，對照組不加任何干預(yù)。PDT損傷組加入10 mg·L-1的 PSD-007 100 μL，4 h后，以630 nm激光照射4 min，能量密度為4.8 J/cm2；槲皮素、茶多酚處理組分別加入槲皮素或茶多酚溶液100 μL，4 h后，分別加入10 mg·L-1的PSD-007溶液100 μL，4 h后，棄上清，加入全培養(yǎng)基100 μL。孵育2 h后，給予630 nm激光照射，能量密度為4.8 J/cm2。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測細胞的活性。

1.8LDH法檢測槲皮素和茶多酚對PSD-007介導(dǎo)PDT效應(yīng)的影響LDH正常情況下存在于細胞內(nèi)，培養(yǎng)上清 LDH活性極低。只有當細胞膜受破壞，膜通透性增高，胞內(nèi)LDH釋放至細胞外，培養(yǎng)上清LDH活性才會升高，而活細胞無此功能，所以培養(yǎng)上清中LDH的含量可反映細胞的死亡或損傷程度。采用LDH法檢測槲皮素、茶多酚對PSD-007介導(dǎo)的PDT的影響，取對數(shù)生長期的PC12細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，實驗分組處理同“1.7”，每組4個復(fù)孔。各組放入CO2培養(yǎng)箱30 min后，吸去上清，每孔加入150 μL LDH釋放劑，搖晃均勻后孵育1 h。每孔吸取上清120 μL放入新孔中，并做好標記。每孔再加入60 μL LDH檢測工作液，混勻后避光放置30 min。用酶標儀在490 nm波長下檢測細胞LDH活性。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié)果

2.1槲皮素和茶多酚對PC12細胞的毒性如Fig 1所示，6.25 μmol·L-1槲皮素使細胞存活率降低10.7%，50～100 μmol·L-1槲皮素使細胞存活率降

Fig 1 Cytotoxicity of quercetin and tea polyphenols on PC12 cells n=4 )

**P<0.01vscontrol

低約21.5%。茶多酚6.25～25 μmol·L-1組細胞存活率無明顯變化；茶多酚(25～100 μmol·L-1)隨濃度增加，細胞存活率降低，100 μmol·L-1茶多酚使細胞存活率降低了33.3%。

2.2PSD-007介導(dǎo)的PDT對PC12細胞的殺傷作用以4.8 J/cm2激光照射后，激光照射對照組細胞存活率100.4%，說明4.8 J/cm2激光對細胞存活率沒有影響。如Fig 2所示，PSD-007(3.25～25 μmol·L-1)對PC12細胞存活率無明顯影響，大于25 mg·L-1時PC12細胞的存活率開始下降，50 mg·L-1時細胞存活率為90%。隨著PSD-007濃度的增加，PDT殺傷效應(yīng)增強，PC12細胞的存活率逐漸下降，在25 μmol·L-1濃度時趨于穩(wěn)定，細胞存活率為65%，不再有明顯降低?？傊?，光敏劑 PSD-007濃度低于25 mg·L-1時，幾乎沒有暗毒性，可以用于后續(xù)PDT實驗。

Fig 2 Effects of PSD-007 and PSD-007 induced PDT on survival rates of PC12 n=4 )

**P<0.01vscontrol

2.3槲皮素和茶多酚對PSD-007PDT效應(yīng)的影響如Fig 3所示，PDT組細胞存活率為83.8%，槲皮素(12.5、25、50 μmol·L-1)組細胞存活率分別增加1.166倍、1.134倍、1.129倍。。槲皮素(12.5～50 μmol·L-1)對光動力效應(yīng)具有拮抗作用，對PC12細胞具有保護作用；茶多酚(12.5、25、50 μmol·L-1)組細胞存活率降低14.0%、8.8%、17.2%，茶多酚(12.5～50 μmol·L-1)對PC12細胞不但沒有保護作用，反而抑制PC12細胞活性，茶多酚與光動力效應(yīng)具有協(xié)同作用。

2.4槲皮素和茶多酚對PDT后LDH的影響如Fig 4A所示，與PDT組相比，槲皮素(12.5、25、50 μmol·L-1)組PC12細胞上清中LDH明顯降低(P<0.01)。如Fig 4B所示，與PDT組相比，茶多酚

Fig 3 Effects of quercetin(A) and tea polyphenols(B)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsPDT

Fig 4 Effects of Que(A) and TP(B) on LDH in PC12 cell supernatant n=4)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsPDT

(12.5、25、50 μmol·L-1)組PC12細胞上清中LDH無明顯變化(P>0.05)?？瞻讓φ战M、PSD-007組、LASER組PC12細胞上清中LDH活性很低。

3 討論

PDT基于細胞攝取光敏劑后，光敏劑經(jīng)合適波長光激發(fā)后，可發(fā)生I型和II型光動力反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧。首先發(fā)生I型反應(yīng)，激發(fā)態(tài)的單線態(tài)氧直接損傷細胞膜或分子，通過質(zhì)子或電子傳遞，生成活性陰離子或陽離子，繼續(xù)與氧和水反應(yīng)，生成自由基和活性氧。PDT產(chǎn)生的單線態(tài)氧等活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，是PDT引起細胞損傷的主要細胞毒性劑。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負面作用，被認為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個重要因素。在神經(jīng)退行性病變中有活性氧增加現(xiàn)象，抗氧化劑可以減緩氧化應(yīng)激帶來的危害。本文選擇使用光動力療法對PC12細胞造成氧化損傷，建立一種檢測體內(nèi)藥物抗氧化能力的新方法，為抗氧化劑的新藥篩選建立一個新模型——PDT氧化應(yīng)激模型法，可用于高通量篩選的新藥藥效篩選模型。

據(jù)報道，γ射線、X射線電離輻射激發(fā)機體產(chǎn)生大量自由基，槲皮素能減輕輻照后細胞內(nèi)氧化損傷，其濃度在 24 μmol·L-1時防護效果最佳[10-11]。槲皮素低濃度(<100 μmol·L-1)時對老年性黃斑變性人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的氧化性損傷具有保護作用[12]。PDT后產(chǎn)生氧自由基氧化損傷PC12細胞，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素在6.25～50 μmol·L-1時， PC12細胞存活率約90%，抑制細胞增殖，槲皮素(50～100 μmol·L-1)表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。槲皮素(12.5～25 μmol·L-1)降低了PDT對PC12細胞的殺傷率，提高了PC12細胞的存活率，降低了上清LDH含量，說明細胞膜是槲皮素保護作用的靶點，槲皮素12.5 μmol·L-1對細胞保護作用最佳。槲皮素具有抗癌作用，但對PDT效應(yīng)具有拮抗作用，具有雙向性，與文獻報道一致[12]。

茶多酚是含有2個以上羥基的多酚類物質(zhì)，具有很強的供氫能力，可以終止自由基鏈反應(yīng)，因而被廣泛作為抗氧化劑應(yīng)用[8]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)：茶多酚(6.25～25 μmol·L-1)組PC12細胞存活率沒有降低，茶多酚(25～100 μmol·L-1)隨濃度增加，細胞存活率逐漸降低，100 μmol·L-1時降低到70%，證明茶多酚具有抗腫瘤作用，與文獻報道[13]，茶多酚是一種具有很強生物學(xué)活性抗腫瘤藥物，已被證實對多種惡性腫瘤均有較強抵抗作用的結(jié)果一致。茶多酚抗癌機制為抑制致癌物前體的代謝活化，抑制腫瘤細胞DNA的復(fù)制，減少DNA損傷，阻斷AP-1信號通路等[4]。與PDT組相比，茶多酚+PDT組PC12細胞存活率明顯降低(P<0.01)，12.5～50 μmol·L-1茶多酚對PDT損傷細胞膜幾乎沒有保護作用，與PDT對PC12細胞具有協(xié)同殺傷作用。

抗氧化劑對PDT氧化是否有保護作用，具有爭議。Frank等[14]發(fā)現(xiàn)，維生素C抑制5-ALA-PDT對癌細胞的氧化作用。Shevchuk等[15]發(fā)現(xiàn)，t-丁基-4-羥基茴香醚可以提高PDT的效率。Kelley等[16]證明，用抗氧化劑金絲桃素介導(dǎo)的PDT對HL-60細胞沒有明顯的保護作用。本實驗用PSD-007誘導(dǎo)PDT氧化損傷PC12細胞，建立抗氧化藥物的細胞模型，可用于高通量藥物活性篩選，打破目前抗氧化實驗只能在體外化學(xué)環(huán)境中進行的局限性。初步篩選出天然抗氧化劑槲皮素對PSD-007損傷PC12細胞具有保護作用，茶多酚對PSD-007損傷PC12細胞具有協(xié)同作用(無保護作用)。除了細胞膜作用靶點外，其他作用機制還需要進一步研究。建立或完善天然抗氧化劑對光動力效應(yīng)影響的數(shù)據(jù)庫，指導(dǎo)接受光動力療法的病人的飲食，有待進一步豐富資料。