迷迭香酸通過Vimentin/NLRP3影響人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖及凋亡

鄭艷俠，姚 楊，蘇 杰，龍麗輝，李相南，羅 娜

(西安醫(yī)學(xué)院 1. 第一附屬醫(yī)院藥劑科、2. 第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室、3. 2014級(jí)臨床藥學(xué)四年制，陜西 西安 710077)

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率近年來呈增高趨勢[1]。目前，臨床上尚未明確原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制，臨床治療以手術(shù)、化療、放療等為主，但預(yù)后差、副作用大等特點(diǎn)使得急需一種新的治療策略[2]，迷迭香酸(rosmarinic acid, RosA)是一種水溶性的酚酸類化合物，在植物中廣泛分布，尤以唇形科和紫草科含量最高[3]。RosA具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腎小球細(xì)胞增殖、抗抑郁等多種藥理作用[4-5]。RosA在癌癥的預(yù)防和治療中也有大量研究，研究表明，RosA可通過抑制炎癥反應(yīng)，抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[6]。波形蛋白(Vimentin)是中間纖維的主要組成部分，參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。研究表明，Vimentin是聯(lián)系“炎癌轉(zhuǎn)化”的重要分子，可驅(qū)動(dòng)NLRP3炎癥小體/caspase-1炎癥信號(hào)[7]。然而，RosA是否通過Vimentin/NLRP3影響肝癌細(xì)胞的增殖及凋亡，尚未見報(bào)道。因此，本研究通過觀察RosA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡及Vimentin/NLRP3蛋白表達(dá)的影響，探討RosA防治肝癌的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑人肝癌細(xì)胞系HepG2為西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。小牛血清(四季青生物工程工司)；RosA購自美國Signal Chemical公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；MTT檢測試劑盒購自北京賽馳公司；TUNEL試劑盒購自Roche公司；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)；抗GAPDH、Vimentin、NLRP3、Bcl-2、caspase-3抗體，均購自Santa Cruz公司；TNF-α、IL-β ELISA試劑盒，購自Abcam公司。

1.2MTT法檢測細(xì)胞增殖HepG2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×104·L-1接種至96孔板中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組和RosA處理組(25、50、100 μmol·L-1)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h。各組細(xì)胞處理結(jié)束前4 h，每孔加入MTT溶液20 μL，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，每孔加入DMSO溶液150 μL，搖床低速振蕩 10 min，使各孔結(jié)晶物充分溶解,采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在570 nm處測各孔OD值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-處理組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.3TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡采用細(xì)胞凋亡試劑盒，按照試劑盒說明書操作，ABC染色法，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為原位末端標(biāo)記陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。采用顯微鏡計(jì)數(shù)法，觀察每個(gè)高倍視野的凋亡細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取3張切片，每張切片6個(gè)視野，凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4Westernblot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液500 μL，混勻，4℃、1 300 r·min-1離心15 min,取上清，BCA法測定蛋白濃度，取50 μg等量蛋白上樣。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h,TBST洗滌3次，每次5 min。加入一抗Vimentin(1 ∶300)、NLRP3(1 ∶500)、Bcl-2 (1 ∶500)、caspase-3 (1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶500)，4℃孵育過夜。次日TBST洗滌3次，每次5 min,加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1 ∶1 000)，室溫孵育2 h，洗膜后顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組目的蛋白的表達(dá)水平。

1.5ELISA法檢測TNF-α和IL-β的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)及分組方法如前，將處理好的細(xì)胞加入ELISA試劑盒的96孔板中，每孔加入100 μL，蓋上封紙，置于37℃孵育2 h。孵育結(jié)束后，移出液體，不清洗，每孔加100 μL稀釋后的檢測試劑A，封口，置于37 ℃孵育1 h, 孵育結(jié)束后，移出液體，用350 μL的洗脫液將96孔板洗3次，每次清洗液在孔中停留1～2 min，吸干液體，于每孔加100 μL稀釋后的檢測試劑B，封口，37℃孵育30 min，結(jié)束后，移出液體，用350 μL洗脫液將96孔板洗4次，洗脫方法如前，吸干液體，于每孔中加90 μL底物溶液，蓋上封紙，孵育20 min，結(jié)束后，于每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在450 nm波長處測吸光度值。

2 結(jié)果

2.1RosA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響RosA處理HepG2細(xì)胞48 h后，F(xiàn)ig 1的MTT結(jié)果顯示， RosA(25～100 μmol·L-1)均能抑制HepG2細(xì)胞的增殖，且隨著給藥濃度的增加，RosA對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)。

2.2RosA對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig 2的TUNEL結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，而RosA作用于肝癌HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞核顏色為黃色，染色質(zhì)皺縮，細(xì)胞形態(tài)無規(guī)則，凋亡指數(shù)隨濃度增加而升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Fig 3的Western blot結(jié)果表明，RosA能下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性。

2.3RosA對(duì)HepG2細(xì)胞Vimentin、NLRP3蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，RosA組均能明顯降低肝癌HepG2細(xì)胞中Vimentin及

Fig 1 Cell viability of HepG2 cells measured after

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2 Effect of RosA on apoptosis of HepG2 n=3)

A:TUNEL results (×200)； a: Control; b: RosA 25 μmol·L-1; c: RosA 50 μmol·L-1; d: RosA 100 μmol·L-1. B: Apoptotic index.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

NLRP3蛋白表達(dá)(P<0.05)，且呈劑量相關(guān)性。

2.4RosA對(duì)HepG2細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-β水平的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證Vimentin對(duì)NLRP3的作用，本研究檢測了NLRP3下游炎癥因子TNF-α

Fig 3 Effects of RosA on Bcl-2 and caspase-3 protein expression in HepG2 cells n=3)

A: Western blot results; B: The quantitative data of Bcl-2 and caspase-3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 4 Effect of RosA on expression of Vimentin and NLRP3 in HepG2 cells n=3)

A: Western blot results; B: The quantitative data of Vimentin and NLRP3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

和IL-β的表達(dá)。如Fig 5所示，與對(duì)照組相比，RosA組TNF-α和IL-β的水平均下降，且呈濃度依賴性。

Fig 5 Effects of RosA on levels of TNF-α and IL-β in HepG2 cells n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

我國每年約有 11～13萬人死于原發(fā)性肝癌，占全球肝癌死亡數(shù)的半數(shù)之多。肝癌的發(fā)病率和死亡率高，預(yù)后效果不理想，因此，迫切需要尋找一種有效的臨床治療方法[8]。某些中成藥提取物具有廣譜、低毒的抗腫瘤作用，因此，受到廣泛的關(guān)注。RosA是一種水溶性多酚羥基化合[9]，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為，楊沛霖等[10]研究表明，RosA能夠抑制CNE-1細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制與調(diào)控PTEN、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。任為等[11]研究也表明，RosA能通過誘導(dǎo)凋亡、抑制NF-κB通路活性，在肝癌H22移植瘤小鼠體內(nèi)發(fā)揮抗肝癌作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，RosA能抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，HBx在RosA干預(yù)下，能促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡[12]。本研究采用RosA(25、50、100 μmol·L-1)作用于HepG2細(xì)胞，結(jié)果表明，不同濃度組對(duì)HepG2細(xì)胞的生長均有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。

腫瘤的發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，腫瘤的免疫治療以及腫瘤微環(huán)境的影響受到越來越多的關(guān)注。炎癥小體是由胞質(zhì)內(nèi)模式識(shí)別受體參與組裝的多蛋白復(fù)合物，能啟動(dòng)和參與炎癥反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，其中NLRP3炎癥小體是目前研究較多的炎癥小體，與多種腫瘤發(fā)生進(jìn)程關(guān)系密切，包括胃癌、直腸癌、肝癌等。而其活化機(jī)制尚不明確，有研究表明，活性氧(reactive oxygen species, ROS)、鉀離子外流模型、脂肪酸等代謝產(chǎn)物均能使其活化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Vimentin也可能是NLRP3炎癥小體的關(guān)鍵調(diào)控因子，在組織損傷和纖維化過程中發(fā)揮作用。Vimentin是一種在間質(zhì)中表達(dá)的Ⅲ型中間絲蛋白，在細(xì)胞分裂時(shí)對(duì)染色體起支架的作用，在眾多上皮來源的惡性腫瘤組織或癌細(xì)胞株中過度表達(dá)，作為一種重要的信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子，參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。卓少元等[13]研究發(fā)現(xiàn)，caspase-3可下調(diào)細(xì)胞中Vimentin蛋白表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲。王紅光等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Vimentin與NF-κB在惡性膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，協(xié)同基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7, MMP-7)高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤遷移及侵襲。而未見Vimentin與NLRP3在肝細(xì)胞增殖及凋亡方面的報(bào)道。本研究結(jié)果表明，不同濃度RosA均能降低肝癌HepG2細(xì)胞Vimentin及NLRP3蛋白表達(dá)，為進(jìn)一步驗(yàn)證Vimentin對(duì)NLRP3 的激活作用，我們檢測了NLRP3下游炎癥因子TNF-α和IL-β的表達(dá)，結(jié)果表明，其下調(diào)趨勢與RosA引起的NLRP3下調(diào)趨勢一致。提示RosA能降低肝癌細(xì)胞的增殖及凋亡，其作用機(jī)制與Vimentin激活NLRP3炎癥通路有關(guān)。

綜上所述，RosA能劑量依賴性地抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控Vimentin/NLRP3信號(hào)通路有關(guān)。根據(jù)本文的結(jié)果，我們將繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以深入確定RosA治療肝癌的機(jī)制，進(jìn)一步推進(jìn)RosA在臨床上的應(yīng)用。