農(nóng)桿菌侵染條件下豇豆高頻再生基因型的篩選

周 雯，吳新義，汪寶根，吳曉花，魯忠富，汪 穎，徐 沛，李國(guó)景，*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州310021)

豇豆(VignaunguiculataL. Walp)，俗稱(chēng)角豆、豆角、帶豆等，屬蝶形花亞科(Fabaceae)，豇豆屬(Vigna)，是豆類(lèi)家族中最重要的栽培豆類(lèi)作物之一。豇豆?fàn)I養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，在我國(guó)栽培歷史悠久，栽培面積大，除高寒地區(qū)外，全國(guó)均有栽培[1]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)現(xiàn)已在功能基因組學(xué)研究和農(nóng)作物品種改良方面發(fā)揮了重要作用。不同作物的轉(zhuǎn)基因難度差異很大，其中外植體的分化成芽率對(duì)轉(zhuǎn)基因效率影響很大。常見(jiàn)豆科植物如大豆、豇豆、菜豆等均屬于較難轉(zhuǎn)化的植物，目前報(bào)道的豇豆轉(zhuǎn)化率僅有1.6%左右[2-3]。即使對(duì)同一作物，其基因型[4]、外植體[5]、農(nóng)桿菌菌株[6]、懸浮液濃度[7-8]、培養(yǎng)基[9]，以及添加的激素[10]等都會(huì)對(duì)分化率和轉(zhuǎn)化率造成影響。基因型是豇豆轉(zhuǎn)基因效率的重要影響因素之一。Brar等[11]研究了不同基因型對(duì)分化率的影響，結(jié)果顯示在36個(gè)豇豆基因型中僅有17個(gè)表現(xiàn)出顯著的再生率。Raji等[12]分析評(píng)估了7個(gè)非洲豇豆基因型，發(fā)現(xiàn)其分化率有顯著差異，最終篩選出2個(gè)分化率較高的基因型。然而，上述基因型與分化率關(guān)系的研究都是在無(wú)農(nóng)桿菌侵染的情況下開(kāi)展的，由于不同豇豆基因型對(duì)農(nóng)桿菌的敏感度有所不同，因此在無(wú)農(nóng)桿菌侵染情況下篩選獲得的分化率好的基因型未必在農(nóng)桿菌侵染條件下表現(xiàn)出類(lèi)似結(jié)果。

本研究從現(xiàn)有的豇豆種質(zhì)資源出發(fā)，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)條件下豇豆的組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)，對(duì)51個(gè)豇豆基因型進(jìn)行篩選，找到了分化率較高的優(yōu)良基因型，為日后農(nóng)桿菌介導(dǎo)下豇豆的轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供的51份豇豆種質(zhì)為材料(表1)，進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染條件下的芽分化率研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 外植體的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]，利用豇豆愈傷組織誘導(dǎo)其再生的頻率很低，而豇豆子葉節(jié)點(diǎn)具有相對(duì)較高的誘導(dǎo)再生率，因此本研究以豇豆子葉節(jié)為誘導(dǎo)芽分化的外植體。

1.2.2 農(nóng)桿菌菌株的選擇

本研究采用攜帶雙元表達(dá)載體pK7WG2(VIB-Plant Systems Biology)的農(nóng)桿菌菌株LBA4404進(jìn)行侵染。

1.2.3 基因型篩選

對(duì)51份豇豆供試材料進(jìn)行兩輪侵染和再生率統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)。在第一次繼代2周后觀察外植體的長(zhǎng)勢(shì)并初步統(tǒng)計(jì)分化率，根據(jù)再生率將基因型分為3個(gè)等級(jí)，其中一級(jí)再生率在80%以上，再生率較高；二級(jí)再生率在50%～80%，再生率居中等水平；三級(jí)再生率在50%以下，再生率較低。

篩選結(jié)束后，對(duì)再生率在80%以上的每個(gè)基因型分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)使用200粒種子，并在第一次繼代2周后統(tǒng)計(jì)分化出新芽的外植體數(shù)和每個(gè)重復(fù)的總側(cè)芽數(shù)，進(jìn)行總體的統(tǒng)計(jì)分析。

表1豇豆供試基因型

Table1Cowpea genotypes for analysis

基因型Genotype來(lái)源地Origin莢長(zhǎng)Podlength/cm基因型Genotype來(lái)源地Origin莢長(zhǎng)Podlength/cm基因型Genotype來(lái)源地Origin莢長(zhǎng)Podlength/cmG360吉林Jilin80.0長(zhǎng)江2號(hào)江西Jiangxi59F龍F(tuán) Long江西Jiangxi63.0Changjiang No.2G98廣西Guangxi85.0H18江西Jiangxi6150-27江西Jiangxi67.0之豇60 Zhijiang 60浙江Zhejiang63.0A43江西Jiangxi5944-68江西Jiangxi60.0銹5 Xiu 5浙江Zhejiang58.0R166-108①浙江Zhejiang58Q白Q Bai江西Jiangxi68.0ZH3.2.3浙江Zhejiang62.0108-R153浙江Zhejiang57麻軍Majun江西Jiangxi61.0之豇616 Zhijiang 616浙江Zhejiang65.0JX3江西Jiangxi6343-57江西Jiangxi61.0長(zhǎng)C△C1.2.1浙江Zhejiang69.0JX5江西Jiangxi61II7E0909山東Shandong62.5Chang C△C1.2.1特早30 Tezao 30浙江Zhejiang60.0JX4浙江Zhejiang59II7E0811遼寧Liaoning19.51162海南Hainan37.6白八月豇浙江Zhejiang22.5II7E0900山東Shandong46.0White August CowpeaII7E0853山東Shandong49.7JX6江西Jiangxi66II7E0826江西Jiangxi51.5II7E0827江西Jiangxi48.8JX7江西Jiangxi59II7E0831江西Jiangxi55.8II7E0815遼寧Liaoning18.3JXHZ江西Jiangxi68II7E0796江蘇Jiangsu52.3II7E0813遼寧Liaoning13.2102黑 102 Hei浙江Zhejiang67II7E0838江西Jiangxi49.2II7E0812遼寧Liaoning12.7H60江西Jiangxi63II7E0778江蘇Jiangsu49.7G314山東Shandong41.541-36江西Jiangxi65II7E0829江西Jiangxi37.8贛蝶二號(hào)江西Jiangxi58.0DMD江西Jiangxi58II7E0801江蘇Jiangsu21.7Gandie No.2汕美2號(hào)廣東Guangdong62.0M-zaas江西Jiangxi61II7E0817遼寧Liaoning24.6Shanmei No.2

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用ANOVA-Duncan檢驗(yàn)(IBM SPSS Statistics 17.0軟件)對(duì)不同基因型材料的再生率進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子消毒處理

取一定量種子放入小燒杯中，在超凈工作臺(tái)中用70%的乙醇消毒60 s，用無(wú)菌水沖洗3次。再加0.1%的升汞浸泡10 min，用無(wú)菌水沖洗3～4遍，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，加無(wú)菌水浸泡過(guò)夜(28 ℃)。

1.3.2 搖菌

采用YEB培養(yǎng)基+50 mg·L-1利福平+50 mg·L-1壯觀霉素+100 mL·L-1農(nóng)桿菌，于28 ℃、200 r·min-1搖床上過(guò)夜培養(yǎng)至D600為0.8～1.2。

1.3.3 外植體的獲取

在超凈工作臺(tái)中，去掉種子的表皮，將種子一分為二，留下有胚軸和胚芽的那一半種子，并在近子葉節(jié)處切除2/3的下胚軸后將種子放入液體懸浮培養(yǎng)基(SCM)中備用。SCM培養(yǎng)基配方：0.443 g·L-1MS粉+30 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1肌醇+3.9 g·L-1MES+0.25 mg·L-1GA3+40 mg·L-1乙酰丁香酮+1.7 mg·L-16-BA+250 mg·L-1硫代硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH至5.4。

1.3.4 侵染

將搖好的農(nóng)桿菌在離心機(jī)上4 000g、10 min離心后倒掉上清液，加入液體懸浮培養(yǎng)基，與菌液混勻后調(diào)D600至0.4～0.6。轉(zhuǎn)入無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，并放入外植體于180 r·min-1搖床上振蕩侵染1 h。

1.3.5 共培養(yǎng)

將培養(yǎng)瓶中的侵染液倒掉，加入液體懸浮培養(yǎng)基清洗3～4次，再用無(wú)菌濾紙吸干種子表面水分，置于共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基(CCM)上(提前在固體培養(yǎng)基上放一張無(wú)菌濾紙)，有胚芽的一面朝上，然后用封口膜封好，放入培養(yǎng)室共培養(yǎng)3 d(28 ℃，16 h光/8 h暗)。CCM培養(yǎng)基配方為0.443 g·L-1MS粉+30 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1肌醇+3.9 g·L-1MES+0.25 mg·L-1GA3+40 mg·L-1乙酰丁香酮+1.7 mg·L-16-BA+250 mg·L-1硫代硫酸鈉+8 g·L-1瓊脂，調(diào)節(jié)pH至5.4。

1.3.6 篩選培養(yǎng)

3 d后將外植體轉(zhuǎn)移至含抗生素(150 mg·L-1卡那霉素)的篩選培養(yǎng)基(SM)上，有胚芽的一面朝下，再用封口膜封好繼續(xù)培養(yǎng)。SM培養(yǎng)基配方：0.443 g·L-1MS粉+30 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1肌醇+0.59 g·L-1MES+1.7 mg·L-16-BA+150 mg·L-1Kanamycin+150 mg·L-1Timentin+8 g·L-1瓊脂，調(diào)節(jié)pH至5.6。

1.3.7 第一次繼代培養(yǎng)

篩選培養(yǎng)2周后，將子葉、伸長(zhǎng)的胚芽和胚軸全部切除，只留下子葉節(jié)部分轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行芽分化誘導(dǎo)。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)觀察

2周后，觀察豇豆外植體的分化率和長(zhǎng)勢(shì)，并進(jìn)行再生率的統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型分化效率初篩選結(jié)果分析

通過(guò)對(duì)51個(gè)豇豆基因型進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染條件下芽分化試驗(yàn)，在第一次繼代培養(yǎng)2周后，觀察不同基因型材料的長(zhǎng)勢(shì)以及再生率(圖1)。將統(tǒng)計(jì)的再生率進(jìn)行等級(jí)劃分，如表2所示，編號(hào)1～24的材料再生率低于50%，為三級(jí)水平；編號(hào)25～41的材料再生率在50%～80%，為二級(jí)水平；編號(hào)42～51的材料再生率高于80%，為一級(jí)水平。

2.2 基因型復(fù)篩結(jié)果分析

經(jīng)過(guò)首輪篩選后發(fā)現(xiàn)有10個(gè)基因型的再生率在80%以上，包括贛蝶二號(hào)、108-R153、50-27、H60、F龍、44-68、特早30、白八月豇、JX6和II7E0815。對(duì)這10個(gè)基因型分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)篩選培養(yǎng)和第一次繼代培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)分化出新芽的外植體數(shù)和每個(gè)重復(fù)的總側(cè)芽數(shù)，并對(duì)繁殖系數(shù)和不定芽誘導(dǎo)率進(jìn)行差異顯著性分析。如表3所示，從繁殖系數(shù)來(lái)看，在這10個(gè)品種中僅有2個(gè)品種的繁殖系數(shù)較高，包括II7E0815和白八月豇，與其他基因型相比表現(xiàn)出顯著差異，尤以白八月豇的繁殖系數(shù)最高，為1.93，其余8個(gè)基因型的繁殖系數(shù)均在1.10～1.45；從不定芽誘導(dǎo)率來(lái)看，白八月豇的不定芽誘導(dǎo)率最高(86.40%)，其次為贛蝶二號(hào)(72.80%)、特早30(70.75%)、44-68(70.33%)、F龍(69.86%)和JX6(66.03%)，這6個(gè)基因型相互之間差異不顯著。不定芽誘導(dǎo)率較低的基因型有50-27、H60和108-R153，分別為36.20%、44.18%和22.51%。

表2五十一個(gè)豇豆基因型再生率的初篩結(jié)果

Table2Regeneration rate in the preliminary screening of 51 cowpea genotypes

編號(hào)No.基因型Genotype供試種子數(shù)Seed number篩選培養(yǎng)后存活下來(lái)的外植體數(shù)Number of explants survivingafter screening and culture第一次繼代培養(yǎng)后存活的外植體數(shù)(總側(cè)芽數(shù))Number of viable explants after subculture(total number of lateral buds)再生率Regenerationrate/%1Q白 Q Bai1802524(1)4.172II7E0831200177160(12)7.503II7E0817200184159(12)7.554長(zhǎng)C△C1.2.1 Chang C△C1.2.1150130101(12)11.885II7E0813200186169(21)12.436II7E0812200180178(26)14.617II7E083820017498(15)15.308II7E0827200160157(25)16.019ZH3.2.315012072(16)22.2010銹5 Xiu 5150132120(29)24.1711II7E0826200195182(44)24.1712II7E0811220204161(44)27.3313102黑 102 Hei20011896(32)33.3314II7E0900200169155(52)33.5515JX4200174117(41)35.0416G314150124108(38)35.191741-3612610596(35)36.461811621509483(33)37.3519II7E082920017295(36)37.8920H1820016695(37)38.9521JXHZ200141135(54)40.0022II7E0853200167128(55)42.9723DMD200159128(61)47.6624R166-108①2009971(34)47.8925II7E0801200181102(53)51.9626II7E0796200165163(90)55.2127G9820010074(44)59.4628II7E0778200172169(102)60.3629JX7200159135(86)63.703043-57200148125(80)64.0031M-zaas200132118(78)66.1032II7E0909200157149(99)66.4433G360150133127(87)68.5034JX5200179148(104)70.2735之豇616 Zhijiang 616150129107(77)71.9636長(zhǎng)江2號(hào) Changjiang No.2200138108(81)75.0037麻軍Majun180136102(78)76.4738A43200171136(105)77.2039之豇60 Zhijiang 60150123111(88)79.2840JX3200132127(101)79.5341汕美2號(hào) Shanmei No.2200177100(80)80.0042H60200150142(114)80.2843108-R153200193140(115)82.144450-27200155153(136)88.8945JX6200161152(136)89.4746F龍F(tuán) Long200172160(150)93.7547贛蝶二號(hào)Gandie No.2200170127(120)94.494844-68200176155(153)98.7149II7E0815200162153(154)100.6550特早30 Tezao 30150127117(123)105.1351白八月豇 White August Cowpea200179152(173)113.82

A，豇豆種子去除種皮后，將子葉一分為二，保留有完整胚芽和胚軸的那一半并切去胚根，準(zhǔn)備侵染；B，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)3 d后的結(jié)果；C，在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩周后的結(jié)果；D，切除子葉、胚芽、胚軸，子葉節(jié)進(jìn)行芽分化誘導(dǎo)；E，較優(yōu)基因型的子葉節(jié)在培養(yǎng)基上兩周后形成簇芽的結(jié)果；F，分化率較差的基因型在第一次繼代后不能分化出芽。A， After removal from seed coat， the cotyledon was divided into two， the half of the complete germ and hypocotyl was retained and the radical was cut off， then the infection was prepared; B， Co-culture with Agrobacterium tumefaciens after 3 d; C， The growth on the screening medium after two weeks; D， After the removal of cotyledons， plumule and hypocotyl， the bud differentiation was induced by cotyledonary; E， The cotyledonary node of the better genotype formed the cluster buds after two weeks in the medium; F， Genotypes with poor differentiation rate could not differentiate buds after first subculture.圖1 豇豆基因型分化率篩選各個(gè)階段圖示Fig.1 Screening in different stages

3 討論

傳統(tǒng)育種方法具有一定局限性，如育種年限長(zhǎng)、篩選工作量巨大等，而轉(zhuǎn)基因手段為新品種培育提供了另一途徑。目前，國(guó)內(nèi)外在豆類(lèi)作物轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域尚未取得重大突破，尤其是針對(duì)豇豆的研究報(bào)道更少。影響豇豆轉(zhuǎn)化效率的因素多種多樣，基因型是豇豆外植體芽分化和基因轉(zhuǎn)化的主要制約因素之一，只有篩選出對(duì)農(nóng)桿菌易感且再生能力強(qiáng)的豇豆基因型，才能更高效地開(kāi)展豇豆轉(zhuǎn)基因研究。

本研究以現(xiàn)有的豇豆種質(zhì)資源為基礎(chǔ)，對(duì)不同豇豆基因型的再生率進(jìn)行研究，通過(guò)首輪篩選后對(duì)再生率在80%以上的10個(gè)基因型進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，依次統(tǒng)計(jì)出芽外植體數(shù)和總側(cè)芽數(shù)并對(duì)繁殖系數(shù)和不定芽誘導(dǎo)率進(jìn)行差異顯著性分析。從繁殖系數(shù)的結(jié)果來(lái)看，僅有II7E0815和白八月豇2個(gè)品種的繁殖系數(shù)較高，其中尤以白八月豇的繁殖系數(shù)最高，為1.93，與其他基因型差異顯著；從不定芽誘導(dǎo)率的結(jié)果來(lái)看，白八月豇的不定芽誘導(dǎo)率最高，其次為贛蝶二號(hào)、特早30、44-68、F龍和JX6，白八月豇與這5個(gè)基因型之間差異均不顯著，而50-27、H60和108-R153的不定芽誘導(dǎo)率較低。因此，在農(nóng)桿菌侵染條件下，地方栽培品種白八月豇具有相對(duì)較高的再生率。本研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明豇豆不同基因型在側(cè)芽分化上存在很大差異，在開(kāi)展轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)之前篩選合適的受體基因型是十分重要的。

除了基因型外，外植體的選擇對(duì)芽的再生也有重要影響。不同外植體在轉(zhuǎn)化效率和再生效率上有很大差別，Gracia等[13-14]利用豇豆的葉盤(pán)作為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但是最終愈傷不能分化出植株；之后Ilori等[15]用花粉作為外植體成功獲得轉(zhuǎn)基因豇豆，但是轉(zhuǎn)化率非常低，只有0.36%；Solleti等[2]利用子葉節(jié)外植體獲得了1.64%的轉(zhuǎn)化率，比前人的研究報(bào)道要高出2倍[16]；Raveendar等[3]也利用子葉節(jié)外植體取得了1.61%的轉(zhuǎn)化率。有研究證明，在有子葉存在的條件下，子葉節(jié)的分化可以得到很大程度的提升[16-17]，且含有一片子葉的子葉節(jié)外植體具有較高的芽分化率[18]。通過(guò)前人的研究，我們發(fā)現(xiàn)豇豆子葉節(jié)外植體在芽分化上具有相對(duì)較好的優(yōu)勢(shì)，因此在本研究中，我們最初選擇帶有一片子葉的豇豆種子作為待侵染外植體，在繼代培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)去除子葉、胚芽和胚軸，僅留下獨(dú)立的子葉節(jié)誘導(dǎo)其芽分化。本研究的結(jié)果表明，以子葉節(jié)為外植體時(shí)，不同豇豆基因型在分化率上存在很大差異，豇豆地方品種白八月豇具有較高的不定芽誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)，此基因型可以作為后續(xù)轉(zhuǎn)基因研究的候選受體材料，以期通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到轉(zhuǎn)基因豇豆植株，并為后續(xù)的基因功能驗(yàn)證和分子育種工作奠定基礎(chǔ)。

表3十個(gè)豇豆基因型芽再生率的復(fù)篩結(jié)果

Table3Shoot regeneration rate in the second screening

品種Variety重復(fù)試驗(yàn)Replicates侵染種子數(shù)Number ofinfectedseeds第一輪繼代外植體數(shù)(長(zhǎng)出新芽外植體數(shù))Number of firstsuccessive explants(number of explantsgrowing)兩周后側(cè)芽分化總數(shù)Total number oflateral buddifferentiationafter two weeks不定芽誘導(dǎo)率Adventitiousbud inductionrate/%繁殖系數(shù)Reproductioncoefficient不定芽誘導(dǎo)率均值A(chǔ)verage value ofAdventitious budinduction rate/%繁殖系數(shù)均值A(chǔ)verage valueof reproductioncoefficient108-R153重復(fù)一Replicate 1200162(39)4724.071.2022.51±2.68 a1.17±0.02 a重復(fù)二Replicate 2200133(23)2617.291.13重復(fù)三Replicate 3200172(45)5326.161.18H60重復(fù)一Replicate 1200150(80)9353.331.1644.18±5.23 abc1.17±0.02 ab重復(fù)二Replicate 2200165(66)7544.001.14重復(fù)三Replicate 3200142(50)6135.211.2250-27重復(fù)一Replicate 1200197(20)2910.151.4536.20±15.19 ab1.29±0.08 abc重復(fù)二Replicate 2200196(123)15062.761.22重復(fù)三Replicate 3200185(66)7935.681.20JX6重復(fù)一Replicate 1200148(92)11662.161.2666.03±13.88 cde1.28±0.03 abc重復(fù)二Replicate 2200158(145)19691.771.35重復(fù)三Replicate 3200154(68)8444.161.24特早30重復(fù)一Replicate 1200187(140)17874.871.2770.75±2.17 de1.22±0.03 abcTezao 30重復(fù)二Replicate 2200189(132)15469.841.17重復(fù)三Replicate 3200191(129)15867.541.22F龍重復(fù)一Replicate 1200147(111)13975.511.2569.86±4.17de1.29±0.07 abcF Long重復(fù)二Replicate 2200162(100)14861.731.48重復(fù)三Replicate 3200170(123)16372.351.33贛蝶二號(hào)重復(fù)一Replicate 1200153(121)13979.081.1572.80±3.22 de1.43±0.17 bcGandie No.2重復(fù)二Replicate 2200157(112)19671.341.75重復(fù)三Replicate 3200148(101)14068.241.3944-68重復(fù)一Replicate 1200152(123)18080.921.4570.33±5.85 de1.44±0.06 c重復(fù)二Replicate 2200176(122)16469.321.34重復(fù)三Replicate 3200163(99)15260.741.54II7E0815重復(fù)一Replicate 1200176(110)21062.501.9159.04±3.42 bcd1.70±0.10 d重復(fù)二Replicate 2200159(83)13252.201.59重復(fù)三Replicate 3200173(108)17262.431.60白八月豇重復(fù)一Replicate 1200190(178)33993.681.9086.40±4.84 e1.93±0.04 dWhite August重復(fù)二Replicate 2200188(166)31188.301.87Cowpea重復(fù)三Replicate 3200180(139)28677.222.01

表中同列數(shù)據(jù)后沒(méi)有相同小寫(xiě)字母的表示差異顯著(P<0.05)。

Values within a column followed by different lowercase letters indicated significant difference (P<0.05).