高山馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳多樣性的同工酶分析

洪森榮，張銘心，葉思雨，寧本松

(上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001)

馬鈴薯為茄科茄屬一年生草本植物，是世界性重要的糧菜兼用作物，在全球主要糧食作物中，排在水稻、小麥和玉米之后，位居第四[1]。高山馬鈴薯一般是指適合種植于高海拔山區(qū)的馬鈴薯品種，如云南的合作88號(hào)和威芋3號(hào)、湖北恩施的鄂馬鈴薯5號(hào)、鄂馬鈴薯11號(hào)和鄂馬鈴薯14號(hào)，以及懷玉山麻籽洋芋等。高山馬鈴薯具有高食用價(jià)值和高營養(yǎng)價(jià)值，成本和技術(shù)要求低，而且高山馬鈴薯的適應(yīng)能力強(qiáng)，對(duì)土壤的肥力、酸堿度、坡度、濕度，以及光照等生存條件要求低，可在山區(qū)、丘陵緩坡大面積種植，其產(chǎn)業(yè)化潛力優(yōu)勢(shì)十分明顯[2]。我國南方大部分地區(qū)屬于高山地區(qū)，獨(dú)特的氣候條件非常適合高山馬鈴薯的生長。2014年，農(nóng)業(yè)部提出馬鈴薯主糧化糧食安全戰(zhàn)略，因此，發(fā)展高山馬鈴薯產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

種質(zhì)資源是遺傳育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的正確評(píng)價(jià)是合理利用種質(zhì)資源的前提，遺傳多樣性是確保物種延續(xù)和不斷進(jìn)化的關(guān)鍵[3]。目前，我國高山馬鈴薯的種植區(qū)域主要集中于湖北恩施、云南曲靖和德宏，以及江西懷玉山等地。開展高山馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，明確其親緣關(guān)系，對(duì)擴(kuò)大高山馬鈴薯品種的遺傳基礎(chǔ)和選育新品種均有重要作用。目前，關(guān)于高山馬鈴薯遺傳多樣性研究尚未見報(bào)道。同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其蛋白多肽鏈結(jié)構(gòu)中的氨基酸排列順序是由DNA上結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息所決定的，通過酶譜分析，就能識(shí)別控制這些譜帶表達(dá)的基因[4]。同工酶的酶譜與等位基因之間有明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此是一種十分有效的遺傳多樣性的檢測(cè)標(biāo)記[5]。本研究采用過氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、多酚氧化酶(PPO)同工酶對(duì)6份高山馬鈴薯品種的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，以期為進(jìn)一步開展高山馬鈴薯品種遺傳改良、雜交親本選配及種質(zhì)資源的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

懷玉山高山馬鈴薯苗，麻籽洋芋，編號(hào)M1～M5，來源于江西懷玉山；懷玉山高山馬鈴薯塊莖，麻籽洋芋，編號(hào)M6～M10，來源于江西懷玉山；云南高山馬鈴薯塊莖，合作88號(hào)，編號(hào)M11～M14，來源于云南德宏盈江；云南高山馬鈴薯塊莖，威芋3號(hào)，編號(hào)M15～M18，來源于云南曲靖；恩施高山馬鈴薯塊莖，鄂馬鈴薯5號(hào)，編號(hào)M19～M22，來源于湖北巴東官渡口鎮(zhèn)；恩施高山馬鈴薯塊莖，鄂馬鈴薯11，編號(hào)M23～M26，來源于湖北巴東官渡口鎮(zhèn)；恩施高山馬鈴薯塊莖，鄂馬鈴薯14，編號(hào)M27～M30，來源于湖北巴東信陵鎮(zhèn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取

將馬鈴薯塊莖清洗干凈，吸干水分，切取0.5 g左右材料(馬鈴薯苗取葉片0.5 g左右)，加入預(yù)先冷卻的研缽中，加液氮研磨成粉末。再加入2.5 mL左右酶提取液繼續(xù)冰上研磨成漿狀，12 000g4 ℃下離心10 min，收集上清即為同工酶粗提液，分裝后于-80 ℃保存。粗酶提取液配方[6]：蔗糖11.98 g、Tris 0.606 g、抗壞血酸鈉0.088 g、半胱氨酸0.030 g和氯化鎂0.020 g溶于80 mL純化水中，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值到7.4，再定容到100 mL。

1.2.2 樣品處理與電泳

所有樣本用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，并用提取液調(diào)整蛋白濃度到5 μg·μL-1。取400 μL粗酶液加入100 μL 5×上樣緩沖液(250 mmol·L-1pH 6.8 Tris-HCl，0.5%溴酚藍(lán)，50%甘油)，混勻后分裝小份于-80 ℃保存。

按常規(guī)方法[6]配制非變性的分離膠和濃縮膠(配方中不加SDS)，其中分離膠濃度為10%。非變性電泳緩沖液，配方為0.025 mol·L-1Tris，0.2 mol·L-1甘氨酸，pH為8.3。

電泳上樣量為10～20 μL，冰水浴電泳。電泳條件為80 V 30 min，再120 V 2～3 h，以溴酚藍(lán)離邊緣1～2 cm為準(zhǔn)。

1.2.3 同工酶染色

POD(過氧化物酶)同工酶。采用聯(lián)苯胺染色法[6]。首先配制顯色液：0.1 g聯(lián)苯胺加5 mL無水乙醇，再加10 mL 1.5 mol·L-1乙酸鈉及10 mL 1.5 mol·L-1乙酸，加蒸餾水75 mL，染色前加5～6滴H2O2原液。其次進(jìn)行顯帶與固定：取出凝膠漂洗后，放入顯色液中，稍加振動(dòng)，片刻即顯示出藍(lán)色酶帶，待酶帶完全出現(xiàn)后，隨即用水沖洗，照相或保存在7%乙酸中。

EST(酯酶)同工酶。參照文獻(xiàn)[6]的方法配制顯色液：7%醋酸-α-萘酯的丙酮溶液0.5 mL，堅(jiān)牢藍(lán)RR 12.5 mg，0.2 mol·L-1Tris-HCl pH 7.1緩沖液1 mL，水23.4 mL。隨后，凝膠在0.2 mol·L-1Tris-HCl pH 7.1的緩沖液中預(yù)浸，然后放在顯色液中，37 ℃保溫30～60 min，至酶帶清晰為止，水沖洗后照相或保存在7%乙酸中。

PPO(多酚氧化酶)同工酶。參照文獻(xiàn)[6]的方法配制染色液：0.5 g對(duì)苯二酚，0.5 g鄰苯二酚，0.02 g對(duì)苯二胺，溶解在少量無水己醇中，再用0.2 mol·L-1pH 6.8磷酸緩沖液定容到100 mL。將凝膠取下后，先用純化水洗滌，再放入染色液中，室溫染色20～30 min。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

凝膠上酶譜帶顏色的深淺反映同工酶活性的強(qiáng)弱，根據(jù)電泳酶帶圖，將酶活性分為強(qiáng)、較強(qiáng)、弱三個(gè)等級(jí)，繪制酶譜模式圖。分別計(jì)算酶帶遷移率Rf和出現(xiàn)頻率Af，Rf=酶帶遷移距離/前沿溴酚藍(lán)距離，Af=酶帶出現(xiàn)次數(shù)/樣本數(shù)。使用popgene軟件計(jì)算各同工酶多態(tài)性百分率和等位基因數(shù)。使用NTsys2.1軟件計(jì)算各同工酶酶譜帶的遺傳相似系數(shù)，并用非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類分析，繪制相似系數(shù)樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 同工酶電泳酶帶圖

不同同工酶用不同的染色方法，各樣本間條帶數(shù)目和強(qiáng)弱也有區(qū)別(圖1)。

2.2 同工酶酶譜模式圖

根據(jù)各同工酶的電泳酶帶圖，繪制出各個(gè)同工酶的酶譜模式圖(圖2)，其中酶活性分為強(qiáng)、較強(qiáng)、弱3個(gè)等級(jí)。模式圖左側(cè)為各種同工酶的不同酶帶命名，右側(cè)為酶帶遷移率Rf。POD同工酶共有10條酶帶，分別命名為POD-01～POD-10，酶帶遷移率Rf為0.034～0.638。EST同工酶共有7條酶帶，分別命名為EST-01～EST-07，酶帶遷移率Rf為0.102～0.492。PPO同工酶共有11條酶帶，分別命名為PPO-01～PPO-11，酶帶遷移率Rf為0.034～0.690。

編號(hào)1～5，懷玉山高山馬鈴薯苗(麻籽洋芋)；編號(hào)6～10，懷玉山高山馬鈴薯塊莖(麻籽洋芋)；編號(hào)11～14，云南高山馬鈴薯塊莖(合作88號(hào))；編號(hào)15～18，云南高山馬鈴薯塊莖(威芋3號(hào))；編號(hào)19～22，恩施高山馬鈴薯塊莖(鄂馬鈴薯5號(hào))；編號(hào)23～26，恩施高山馬鈴薯塊莖(鄂馬鈴薯11)；編號(hào)27～30，恩施高山馬鈴薯塊莖(鄂馬鈴薯14)。No. 1-5， Huaiyushan alpine potato plantlets (Maziyangyu); No. 6-10， Huaiyushan alpine potato tuber (Maziyangyu); No. 11-14， Yunnan alpine potato tuber (Hezuo No. 88); No. 15-18， Yunnan alpine potato tuber (Weiyu No. 3); No. 19-22， Enshi alpine potato (Hubei potato No. 5); No. 23-26， Enshi alpine potato tuber (Hubei potato 11); No. 27-30， Enshi alpine potato tuber (Hubei potato 14).圖1 POD(A)、EST(B)、PPO(C)同工酶Fig.1 POD(A)， EST(B)， PPO(C) isozyme

2.3 同工酶酶帶遷移率(Rf)、出現(xiàn)頻率(Af)、多態(tài)性百分率(P)及有效等位基因數(shù)(ne)

計(jì)算各同工酶酶帶遷移率(Rf)及出現(xiàn)頻率(Af)，并利用popgene軟件[7]計(jì)算出POD、EST和PPO同工酶多態(tài)性百分率(P)和有效等位基因數(shù)(ne)(表1)。

從表1可以看出，POD同工酶中的3條帶(POD-03、POD-05和POD-10)為所有樣本共有條帶(ne為1.000 0)，其余7條均為多態(tài)性條帶，因此POD同工酶的多態(tài)性比率(P)為7/10=70%。出現(xiàn)頻率Af最高的是POD-03、POD-05和POD-10，為100%；其次是POD-01和POD-02，Af為60%，POD-01對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M1～M10、M15～M18和M27～M30，POD-02對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M1～M10和M23～M30；POD-08出現(xiàn)頻率Af為56.67%，對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M1～M5和M19～M30；POD-06和POD-07，Af為33.33%，對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)均為M1～M10；POD-04和POD-09，Af為16.67%，POD-04對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M6～M10，POD-09對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M1～M5。

圖2 POD(A)、EST(B)、PPO(C)同工酶模式圖Fig.2 POD(A)， EST(B)， PPO(C) isozyme pattern map

EST同工酶無共有條帶(ne為1.000 0)，所有條帶(7條)均為多態(tài)性條帶，因此EST同工酶的多態(tài)性比率(P)為7/7=100%。出現(xiàn)頻率Af最高的是EST-05和EST-06，為83.33%，對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)均為M6～M30；其次是EST-04，Af為66.67%，對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M11～M30；EST-01，Af為60.00%，對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M1～M10、M15～M18和M27～M30；EST-02和EST-07，Af為43.33%，EST-02對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M6～M14和M19～M22，EST-07對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M6～M10和M23～M30；EST-03，Af最低為30.00%，對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M6～M14。

表1POD、EST、PPO同工酶酶帶遷移率(Rf)、出現(xiàn)頻率(Af)及有效等位基因數(shù)(ne)

Table1Enzyme band mobility (Rf)， frequency of occurrence (Af) and effective allele number (ne) of POD， EST and PPO isozyme

酶帶Enzyme bandRfAf/%nePOD-010.03460.001.9231POD-020.13860.001.9231POD-030.207100.001.0000POD-040.31016.671.3846POD-050.379100.001.0000POD-060.46633.331.8000POD-070.51733.331.8000POD-080.55256.671.9651POD-090.60316.671.3846POD-100.638100.001.0000EST-010.10260.001.9231EST-020.25443.331.9651EST-030.32230.001.7241EST-040.37366.671.8000EST-050.42483.331.3846EST-060.45883.331.3846EST-070.49243.331.9651PPO-010.03446.671.9231PPO-020.08616.671.3846PPO-030.20730.001.7241PPO-040.31033.331.8000PPO-050.37986.671.3006PPO-060.46646.671.9912PPO-070.51733.331.8000PPO-080.55216.671.3846PPO-090.60316.671.3846PPO-100.638100.001.0000PPO-110.69016.671.3846

PPO同工酶中的只有1條帶(PPO-10)為所有樣本共有條帶(ne為1.000 0)，其余10條均為多態(tài)性條帶，因此PPO同工酶的多態(tài)性比率(P)為10/11=90.91%。出現(xiàn)頻率Af最高的是PPO-10，為100.00%；其次是PPO-05，Af為86.67%，對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M1～M18和M23～M30；PPO-01和PPO-06，Af為46.67%，PPO-01對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M1～M10和M15～M18，PPO-06對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M1～M14；PPO-04和PPO-07，Af為33.33%，對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)均為M1～M10；PPO-03，Af為30.00%，對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M6～M10和M27～M30；PPO-02、PPO-08、PPO-09和PPO-11，Af為16.67%，PPO-02、PPO-08和PPO-09對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)均為M1～M5，PPO-11對(duì)應(yīng)樣本編號(hào)為M6～M10。

2.4 同工酶相似系數(shù)及聚類分析

使用NTsys2.1軟件[7]計(jì)算各同工酶酶譜帶的遺傳相似系數(shù)(表2～4)，用非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類分析并繪制的相似系數(shù)樹狀聚類圖如圖3。

從圖3-A的POD聚類分析圖來看，在遺傳相似系數(shù)0.650處，30個(gè)樣本可分為二大組，M1～M10為第1組，而M11～M30為第2組，表明云南高山馬鈴薯和恩施高山馬鈴薯均屬于同一類，而懷玉山高山馬鈴薯單獨(dú)成一類。從圖3-B的EST聚類分析圖來看，在遺傳相似系數(shù)0.398處，30個(gè)樣本可分為2大組，M1～M5為第1組，而M6～M30為第2組，表明分別采用塊莖和苗來做EST同工酶檢測(cè)時(shí)，結(jié)果是不一樣的，可能是由于塊莖和苗的EST活力不一致造成的；但在遺傳相似系數(shù)0.534處，M6～M30還可分為2個(gè)亞組，M6～M10為第1亞組，而M11～M30為第2亞組，表明云南高山馬鈴薯和恩施高山馬鈴薯均屬于同一類，而懷玉山高山馬鈴薯單獨(dú)成一類。從圖3-C的PPO聚類分析圖來看，在遺傳相似系數(shù)0.486處，30個(gè)樣本可分為2大組，M1～M10為第1組，而M11～M30為第2組，再次表明云南高山馬鈴薯和恩施高山馬鈴薯均屬于同一類，而懷玉山高山馬鈴薯單獨(dú)成一類。

表2POD同工酶相似系數(shù)

Table2Similarity coefficients of POD isozyme

NO12345678910111213141516171819202122232425262728293011.0021.001.0031.001.001.0041.001.001.001.0051.001.001.001.001.0060.700.700.700.700.701.0070.700.700.700.700.701.001.00880.700.700.700.700.701.001.001.0090.700.700.700.700.701.001.001.001.00100.700.700.700.700.701.001.001.001.001.00110.400.400.400.400.400.500.500.500.500.501.00120.400.400.400.400.400.500.500.500.500.501.001.00130.400.400.400.400.400.500.500.500.500.501.001.001.00140.400.400.400.400.400.500.500.500.500.501.001.001.001.00150.500.500.500.500.500.600.600.600.600.600.900.900.900.901.00160.500.500.500.500.500.600.600.600.600.600.900.900.900.901.001.00170.500.500.500.500.500.600.600.600.600.600.900.900.900.901.001.001.00180.500.500.500.500.500.600.600.600.600.600.900.900.900.901.001.001.001.00190.500.500.500.500.500.400.400.400.400.400.900.900.900.900.800.800.800.801.00200.500.500.500.500.500.400.400.400.400.400.900.900.900.900.800.800.800.801.001.00210.500.500.500.500.500.400.400.400.400.400.900.900.900.900.800.800.800.801.001.001.00220.500.500.500.500.500.400.400.400.400.400.900.900.900.900.800.800.800.801.001.001.001.00230.600.600.600.600.600.500.500.500.500.500.800.800.800.800.700.700.700.700.900.900.900.901.00240.600.600.600.600.600.500.500.500.500.500.800.800.800.800.700.700.700.700.900.900.900.901.001.00250.600.600.600.600.600.500.500.500.500.500.800.800.800.800.700.700.700.700.900.900.900.901.001.001.00260.600.600.600.600.600.500.500.500.500.500.800.800.800.800.700.700.700.700.700.900.900.900.901.001.001.001.00270.700.700.700.700.700.600.600.600.600.600.700.700.700.700.800.800.800.800.800.800.800.800.900.900.900.901.00280.700.700.700.700.700.600.600.600.600.600.700.700.700.700.800.800.800.800.800.800.800.800.900.900.900.901.001.00290.700.700.700.700.70.700.600.600.600.600.600.700.700.700.700.800.800.800.800.800.800.800.80.80.900.900.900.901.001.00300.700.700.700.700.700.600.600.600.600.600.700.700.700.700.800.800.800.800.800.800.800.800.800.900.900.900.901.001.001.00

表3EST同工酶相似系數(shù)

Table3Similarity coefficients of EST isozyme

NO12345678910111213141516171819202122232425262728293011.0021.001.0031.001.001.0041.001.001.001.0051.001.001.001.001.0060.290.290.290.290.291.0070.290.290.290.290.291.001.0080.290.290.290.290.291.001.001.0090.290.290.290.290.291.001.001.001.00100.290.290.290.290.291.001.001.001.001.00110.140.140.140.140.140.570.570.570.570.571.00120.140.140.140.140.140.570.570.570.570.571.001.00130.140.140.140.140.140.570.570.570.570.571.001.001.00140.140.140.140.140.140.570.570.570.570.571.001.001.001.00150.570.570.570.570.570.430.430.430.430.430.570.570.570.571.00160.570.570.570.570.570.430.430.430.430.430.570.570.570.571.001.00170.570.570.570.570.570.430.430.430.430.430.570.570.570.571.001.001.00180.570.570.570.570.570.430.430.430.430.430.570.570.570.571.001.001.001.00190.290.290.290.290.290.430.430.430.430.430.860.860.860.860.710.710.710.711.00200.290.290.290.290.290.430.430.430.430.430.860.860.860.860.710.710.710.711.001.00210.290.290.290.290.290.430.430.430.430.430.860.860.860.860.710.710.710.711.001.001.00220.290.290.290.290.290.430.430.430.430.430.860.860.860.860.710.710.710.711.001.001.001.00230.290.290.290.290.290.430.430.430.430.430.570.570.570.570.710.710.710.710.710.710.710.711.00240.290.290.290.290.290.430.430.430.430.430.570.570.570.570.710.710.710.710.710.710.710.711.001.00250.290.290.290.290.290.430.430.430.430.430.570.570.570.570.710.710.710.710.710.710.710.711.001.001.00260.290.290.290.290.290.430.430.430.430.430.570.570.570.570.710.710.710.710.710.710.710.711.001.001.001.00270.430.430.430.430.430.570.570.570.570.570.430.430.430.430.860.860.860.860.570.570.570.570.860.860.860.861.00280.430.430.430.430.430.570.570.570.570.570.430.430.430.430.860.860.860.860.570.570.570.570.860.860.860.861.001.00290.430.430.430.430.430.570.570.570.570.570.430.430.430.430.860.860.860.860.570.570.570.570.860.860.860.861.001.001.00300.430.430.430.430.430.570.570.570.570.570.430.430.430.430.860.860.860.860.570.570.570.570.860.860.860.861.001.001.001.00

表4PPO同工酶相似系數(shù)

Table4Similarity coefficients of PPO isozyme

NO12345678910111213141516171819202122232425262728293011.0021.001.0031.001.001.0041.001.001.001.0051.001.001.001.001.0060.700.700.700.700.701.0070.700.700.700.700.701.001.0080.700.700.700.700.701.001.001.0090.700.700.700.700.701.001.001.001.00100.700.700.700.700.701.001.001.001.001.00110.400.400.400.400.400.500.500.500.500.501.00120.400.400.400.400.400.500.500.500.500.501.001.00130.400.400.400.400.400.500.500.500.500.501.001.001.00140.400.400.400.400.400.500.500.500.500.501.001.001.001.00150.500.500.500.500.500.600.600.600.600.600.900.900.900.901.00160.500.500.500.500.500.600.600.600.600.600.900.900.900.901.001.00170.500.500.500.500.500.600.600.600.600.600.900.900.900.901.001.001.00180.500.500.500.500.500.600.600.600.600.600.900.900.900.901.001.001.001.00190.500.500.500.500.500.400.400.400.400.400.900.900.900.900.800.800.800.801.00200.500.500.500.500.500.400.400.400.400.400.900.900.900.900.800.800.800.801.001.00210.500.500.500.500.50.400.400.400.400.400.900.900.900.900.800.800.800.801.001.001.00220.500.500.500.500.500.400.400.400.400.400.900.900.900.900.800.800.800.801.001.001.001.00230.600.600.600.600.600.500.500.500.500.500.800.800.800.800.700.700.700.700.900.900.900.901.00240.600.600.600.600.600.500.500.500.500.500.800.800.800.800.700.700.700.700.900.900.900.901.001.00250.600.600.600.600.600.500.500.500.500.500.800.800.800.800.700.700.700.700.900.900.900.901.001.001.00260.600.600.600.600.600.500.500.500.500.500.800.800.800.800.700.700.700.700.900.900.900.901.001.001.001.00270.700.700.700.700.700.600.600.600.600.600.700.700.700.700.800.800.800.800.800.800.800.800.900.900.900.901.00280.700.700.700.700.700.600.600.600.600.600.700.700.700.700.800.800.800.800.800.800.800.800.900.900.900.901.001.00290.700.700.700.700.700.600.600.600.600.600.700.700.700.700.800.800.800.800.800.800.800.800.900.900.900.901.001.001.00300.700.700.700.700.700.600.600.600.600.600.700.700.700.700.800.800.800.800.800.800.800.800.900.900.900.901.001.001.001.00

圖3 POD(A)、EST(B)、PPO(C)同工酶聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis results of POD(A)， EST(B)， PPO(C) isozyme

3 討論

同工酶是指催化功能相同而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的一組特異性蛋白質(zhì)，其蛋白多肽鏈結(jié)構(gòu)中的氨基酸排列順序是由DNA上結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息決定的[3]。同工酶分析是一種有效的生化標(biāo)記技術(shù)，它與形態(tài)學(xué)及分子分類方法相比有自身的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛地應(yīng)用于作物種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析[4]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)研究生物多樣性也越來越廣泛，但相比而言，同工酶分析方法和設(shè)備操作簡單，且具有試樣需要量少、成本低、實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間短、分析靈敏度高、共顯性表達(dá)、能間接反映DNA水平的變化等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于遺傳、生物多樣性和群體遺傳學(xué)等研究[8]。常用的同工酶主要有過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、酯酶(EST)、多酚氧化酶(PPO)、淀粉酶等。丁玲等[9-10]對(duì)菊花品種的遺傳多樣性進(jìn)行了POD和EST同工酶檢測(cè)，結(jié)果表明，菊花品種間POD和EST的遺傳變異豐富，且菊屬8個(gè)種27份材料聚類為兩組，第Ⅰ組為野生菊、藥用菊，第Ⅱ組為觀賞菊。隋益虎等[4]基于葉片的POD、SOD及花蕾的EST同工酶酶譜的分析發(fā)現(xiàn)，32份辣椒材料的遺傳分化程度較大。王述民等[11]對(duì)58份野生小豆和249份栽培小豆種質(zhì)資源進(jìn)行了EST、POD、蘋果酸脫氫酶(MDH)和SOD的檢測(cè)分析，共檢測(cè)到6個(gè)基因位點(diǎn)，33個(gè)等位基因，可劃分為5個(gè)組群，類群之間存在明顯的遺傳差異。劉賀賀等[5]對(duì)75份蕨麻進(jìn)行了POD同工酶分析，結(jié)果與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞水平、分子標(biāo)記研究的結(jié)果一致，具有豐富的遺傳多樣性。胡樹貴等[12]對(duì)44個(gè)百合品種葉樣進(jìn)行了POD、EST、SOD、PPO同工酶檢測(cè)，結(jié)果表明，東方百合與野生百合的遺傳相似度最小，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而日本百合與野生百合的遺傳相似度最大，親緣關(guān)系最近。陳萬秋等[13]對(duì)獼猴桃10個(gè)品種進(jìn)行EST同工酶和POD同工酶的遺傳多樣性檢測(cè)，結(jié)果表明，獼猴桃種內(nèi)遺傳多樣性水平較高。李景欣等[14]對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)的16份野生冰草種質(zhì)資源進(jìn)行EST和POD同工酶分析，顯示了較高的多態(tài)性，類群之間存在明顯的遺傳差異。沈鏑等[15]用EST、POD、SOD、PPO、細(xì)胞色素氧化酶對(duì)云南48份芋材料進(jìn)行同工酶分析，結(jié)果表明，云南省芋種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。在本實(shí)驗(yàn)中，6份高山馬鈴薯種質(zhì)資源的POD、EST、PPO同工酶分析結(jié)果表明，云南高山馬鈴薯和恩施高山馬鈴薯均屬于同一類，而懷玉山高山馬鈴薯單獨(dú)成一類。關(guān)于馬鈴薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，多采用DNA分子標(biāo)記的方法，如SSR[16]、ISSR[17]、SRAP[17]、RAPD[18]、AFLP[19]等。對(duì)于馬鈴薯種質(zhì)資源同工酶的檢測(cè)僅限于轉(zhuǎn)基因純合四倍體馬鈴薯PPO檢測(cè)[20]、馬鈴薯種間體細(xì)胞雜種植株P(guān)OD檢測(cè)[21]等，而關(guān)于高山馬鈴薯的研究也僅限于脫毒和繁育[22]。本實(shí)驗(yàn)通過POD、EST、PPO同工酶電泳分析了我國主要產(chǎn)地的高山馬鈴薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性，指出了云南高山馬鈴薯和恩施高山馬鈴薯的遺傳分化較低，而懷玉山高山馬鈴薯為特有的種質(zhì)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于同一馬鈴薯種質(zhì)，取不同部位的材料(如塊莖和葉片)來做同工酶檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生不一樣的結(jié)果，這說明同工酶的檢測(cè)需要保證材料選擇的一致性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為我國高山馬鈴薯種質(zhì)資源的保存和育種提供理論依據(jù)。