溫敏水凝膠/磷酸三鈣生物復(fù)合材料的制備及其在小鼠體內(nèi)的成骨研究

程麗佳， 陳 濤， 陳祖盛， 吳?；郏?牛 蓓

(成都大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 四川 成都 610106)

0 引 言

據(jù)報道，目前在全球范圍內(nèi)每年都有近1 500萬骨折病例的發(fā)生，導(dǎo)致骨移植的市場需求量不斷增加[1-2].而由創(chuàng)傷、骨質(zhì)疏松等原因造成的骨折和骨缺損具有一定的再生和自我修復(fù)能力，但人體骨的自我修復(fù)周期較長，且缺損超過一定大小，便不能自我修復(fù)愈合[3].嚴(yán)重的骨缺損需要通過骨移植來進(jìn)行治療，而自體骨和異體骨取材十分有限，也存在著免疫排斥反應(yīng)等限制了其應(yīng)用[4].研究發(fā)現(xiàn)，含羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)和磷酸三鈣(Tricalcium Phosphate,TCP)的生物陶瓷因和骨組織具有相似的理化性質(zhì)，以及良好的生物相容性、生物降解性、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性而常被用作骨替代物[5-8].但鈣磷生物材料其粉體為無定形粉末，直接應(yīng)用無法塑形，同時存在強度低、固化慢等缺點，影響了其臨床應(yīng)用.溫敏水凝膠(Thermo-sensitive Hydrogel,TSH)聚合物是由一定比例的DL-丙交酯、乙交酯和聚乙二醇合成，其特點是在溫度低于相轉(zhuǎn)變溫度(25±2)℃時，聚合物可溶于水形成自由流動液體，而當(dāng)溫度升高至相轉(zhuǎn)變溫度以上時，聚合物的水溶液形成凝膠形狀，且凝膠形成的過程是可逆的[9].同時，TSH又是一種高分子材料，可作為固化液，在體內(nèi)可起到緩釋TCP的作用，其能將Ca、P離子緩慢釋放并誘導(dǎo)形成新生骨組織，可解決TCP粉體需要燒結(jié)成型的缺點.基于此，本研究擬利用TSH在低溫下溶解、高溫下固化的特點及TCP的骨誘導(dǎo)性，在二者協(xié)同作用下制備出一種生物力學(xué)特性與天然骨相似的新型骨修復(fù)/再生材料，擬為骨替代物材料的開發(fā)提供新的路徑.

1 材料和方法

1.1 材 料

實驗所用的材料包括：TSH，購自濟南岱罡生物工程有限公司；HA、TCP，由四川大學(xué)生物材料中心贈送；BALB/c小鼠，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司.

1.2 TSH/TCP材料制備

稱取5 g TSH與20 mL蒸餾水混合，放置于4 ℃冰箱中，每24 h攪拌30 min進(jìn)行混合，3 d后得到TSH混合懸浮液.然后，按24∶76的比例加入TCP粉體，將TCP粉體與TSH懸浮液進(jìn)行混合,得到TSH/TCP混合材料.最后，將TSH/TCP混合材料置于27 ℃以上，加工制得TSH/TCP復(fù)合材料.根據(jù)其可任意塑形的特性，可按需放置在模具中制成所需的形狀.

1.3 材料結(jié)構(gòu)

實驗采用邵氏硬度檢測材料硬度，利用掃描電子顯微鏡分析HA、β-TCP和TSH/TCP 3種生物材料的微觀結(jié)構(gòu).

1.4 動物實驗

30只7周周齡的BALB/c小鼠隨機分為3組(n=10)，即∶TSH/TCP組(實驗組)、HA組(對照組1)及β-TCP組(對照組2).實驗中，采用1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉(0.1 mg/g體重)所有小鼠，然后，對小鼠兩側(cè)大腿進(jìn)行常規(guī)消毒、剃毛、備皮，切開皮膚和肌肉，制備肌袋，將3種生物材料分別植入肌袋，最后逐層縫合肌肉和皮膚.術(shù)后觀察小鼠正?；顒樱⒆⑸淝嗝顾?.2萬單位/g，5 d，預(yù)防感染.

1.5 組織學(xué)染色

術(shù)后12周，處死小鼠，解剖后觀察小鼠體內(nèi)有無異物或腫瘤組織形成，同時收獲材料并置于10%中性福爾馬林固定24 h，10% EDTA(pH值為7.0)脫鈣，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，然后制成5 μm 厚連續(xù)切片，切片行蘇木素—伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson三色(Masson's trichrome)染色、番紅固綠(safranin-fast green,SFG)染色和亞甲基藍(lán)—酸性品紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察新生骨組織形成情況.其中，HE染色使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色，可鑒定骨組織；Masson三色染色區(qū)分膠原纖維和肌纖維，可鑒定膠原組織；SFG染色觀察軟骨組織，可鑒定成骨途徑是否是軟骨內(nèi)成骨；亞甲基藍(lán)—酸性品紅染色使骨組織染色，可鑒定成骨細(xì)胞和新生骨組織.

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

每個石蠟塊連續(xù)切片5張，HE染色切片于顯微鏡下采圖，用Image-Pro plus 6.0軟件對其中的新生骨組織面積進(jìn)行統(tǒng)計，計算每組新生骨組織的面積百分?jǐn)?shù).所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)采用Student T檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 材料特征

3種生物材料的掃描電鏡觀察結(jié)果如圖1所示.

圖1 HA、TCP和TSH/TCP 3種材料的掃描電鏡觀察結(jié)果

由圖1可見，HA材料硬度較大，孔隙率低，孔與孔之間互不連通；β-TCP材料硬度低，孔隙率較高，孔之間相互貫通，難以用作承重的骨移植材料；TSH/TCP復(fù)合材料，孔較多，孔隙率高，孔徑范圍在100 μm左右，能為纖維組織和骨組織提供通過和生長空間，起到骨組織的修復(fù)作用，且有TSH附著于材料中，起到塑形作用，大孔與小孔之間相連，更有利于血管的滲透，為新骨的生成提供營養(yǎng).研究表明，人工骨的孔徑在15～40 μm之間時，纖維組織可以長入骨組織內(nèi)部；當(dāng)孔徑范圍在45～100 μm時，非礦物的骨樣可以長入骨內(nèi)部；而當(dāng)孔徑在150 μm時，骨組織可以長入材料內(nèi)部[9].TSH/TCP邵氏硬度為62，硬度較HA和β-TCP大，具有良好的力學(xué)性能.

2.2 成骨性能比較

3種生物材料的HE染色結(jié)果如圖2所示.

注：三種生物材料細(xì)胞核呈藍(lán)色，骨組織、細(xì)胞質(zhì)、肌纖維和膠原纖維呈深淺不一的紅色.

圖2 HA、TCP和TSH/TCP HE染色結(jié)果

圖2結(jié)果顯示，HA組中，未觀察到任何新生骨組織，僅有大量新生血管、纖維結(jié)締組織和間充質(zhì)組織；β-TCP組中，新生骨組織在材料邊緣連片生長，這些新生骨組織已成熟為板層骨，材料內(nèi)部有大量纖維結(jié)締組織長入；TSH/TCP 組中，大量新生編織骨組織遍布在材料中，成骨細(xì)胞鑲嵌在骨陷窩里，同時，骨組織周圍可見水凝膠附著在邊緣，有向材料內(nèi)部長滿的趨勢.

2.3 骨組織鑒定

為鑒定TSH/TCP材料中形成的異位骨組織，進(jìn)行了Masson三色染色、番紅固綠染色和亞甲基藍(lán)—酸性品紅染色，結(jié)果如圖3所示.

注：Masson三色染色中，膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色；番紅固綠染色中，細(xì)胞漿、肌肉、膠原纖維及骨組織呈灰綠色，細(xì)胞核呈灰黑色；亞甲基藍(lán)—酸性品紅染色中，成骨細(xì)胞為深藍(lán)色，細(xì)胞基質(zhì)為淡藍(lán)色，類骨質(zhì)成紫灰色.

圖3骨組織鑒定結(jié)果

圖3結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞沿著骨組織線性排列，骨陷窩鑲嵌在骨組織中，骨組織中的膠原纖維排列有序，兩種染色均未發(fā)現(xiàn)軟骨組織，表明材料誘導(dǎo)的異位骨組織是通過膜內(nèi)成骨形成的.

2.4 新骨面積百分?jǐn)?shù)

3種生物材料的新骨面積統(tǒng)計結(jié)果如表1所示.

表1 新骨面積百分?jǐn)?shù)

從表1數(shù)據(jù)可以看出，HA組中沒有任何骨組織形成，TCP組中新骨面積百分?jǐn)?shù)為(10.47±1.57)%，TSH/TCP組中新骨面積百分?jǐn)?shù)為(8.30±1.38)%，P>0.05，兩組沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，表明TSH/TCP生物材料的成骨能力與TCP相當(dāng).

3 結(jié) 論

本研究所采用的TSH在溫度低于相轉(zhuǎn)變溫度(25±2)℃時，聚合物可溶于水形成自由流動液體，而當(dāng)溫度升高至相轉(zhuǎn)變溫度以上，聚合物的水溶液形成凝膠形狀，凝膠形成的過程是可逆的，是一種良好的黏合材料，將其與TCP混合制備成TSH/TCP復(fù)合材料可提高TCP的硬度，并增加材料的彈性.目前，生物材料在大動物體內(nèi)誘導(dǎo)異位骨形成的現(xiàn)象已被大量報道，而小鼠體內(nèi)的骨誘導(dǎo)現(xiàn)象僅有零星的報道[10-11].本研究證實了，不管是傳統(tǒng)的TCP材料，還是新型的TSH/TCP材料，均能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)異位骨形成，此為探討骨誘導(dǎo)的機制提供了相關(guān)線索.同時，本研究還證明了，TSH/TCP材料不僅是一種具有良好的生物相容性、生物降解性和骨誘導(dǎo)能力的復(fù)合材料，而且制備方法簡單，應(yīng)用時可按實際需要任意塑形.研究表明，TSH/TCP材料還具有與TCP材料相當(dāng)?shù)某晒悄芰Γ矣懈鼜姷挠捕群透玫膹椥?，有望作為一種新型人工骨修復(fù)材料.