小鼠結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)展過程中大腸組織IL-9的表達

孫正路，張艷停，徐 剛，朱 麗，張曉珊，崔廣林

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

炎癥已被證實是腫瘤進展的關(guān)鍵組成部分，許多癌癥來自感染部位的慢性刺激和炎癥。結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)又稱大腸癌。根據(jù)與炎癥反應(yīng)的關(guān)系，CRC可分為兩類：散發(fā)性結(jié)直腸癌(sporadic CRC，SCRC)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC) 相關(guān)的結(jié)直腸癌。目前研究[1-2]表明，慢性炎癥是CRC的三大高危因素之一。近來的研究[3-5]顯示，白介素9(interleukin 9，IL-9)是一個重要的促炎細(xì)胞因子，參與腸道炎癥的發(fā)生，與實驗性UC的炎癥程度密切相關(guān)。IL-9與結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌(colitis associated colorectal cancer，CAC)關(guān)系的研究報道較少。該研究中作者觀察了小鼠CAC模型從癌前病變到癌演變過程中大腸組織IL-9表達的動態(tài)變化，報道如下。

1 材料與方法

1.1材料雄性ICR小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，5周齡，無特異性病原體，體重25～30 g。葡聚糖硫酸鈉(DSS,相對分子質(zhì)量50 000，上海西寶生物制劑公司)，1,2-二甲肼(DMH, 相對分子質(zhì)量133.02，上海阿拉丁試劑有限公司)，免疫組化ABC試劑盒(美國AEC Vector公司)，山羊抗小鼠IL-9抗體、兔抗小鼠β-tublin抗體(美國R&D公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的馬抗山羊抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(北京鼎國生物公司)。

1.2小鼠CAC模型的建立60只雄性ICR小鼠飼養(yǎng)在溫度(23±2) ℃、濕度(50±5)%、晝夜對半、氨濃度不超過14 mg/m3的環(huán)境中，自由飲食飲水，食物及飲水均經(jīng)過滅菌處理，每周添料換水3～4次，稱重并記錄。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為實驗組(n=30)和對照組(n=30)。實驗組小鼠腹腔內(nèi)每周注射1次4 g/L的DMH，用量為25 mg/kg，定時飲食飲水7 d，再換為自由飲用10 g/L DSS 7 d，如此為一個周期，持續(xù)給藥。對照組小鼠每周腹腔注射一次生理鹽水，用量為25 mg/kg。實驗組和對照組分別于14、18和22周處死10只小鼠。該項研究內(nèi)容和過程已通過鄭州大學(xué)生命科學(xué)倫理審查委員會的審核。

1.3小鼠生長情況觀察小鼠活動量、精神情況、飲食變化，記錄其體重的變化、糞便性狀及便血情況。

1.4標(biāo)本采集乙醚麻醉后處死小鼠，剪開腹腔，分離大腸并用眼科剪縱行剪開，PBS清洗，肉眼觀察有無潰瘍、結(jié)節(jié)及腺瘤，記錄腺瘤的個數(shù)及直徑。此后組織標(biāo)本分為兩部分，分別用于后續(xù)實驗。

1.5免疫組化法檢測大腸組織中IL-9蛋白的表達大腸組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。根據(jù)ABC試劑盒說明書操作。組織切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、煮沸熱法修復(fù)抗原，體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫-非特異性IgG封閉和阻斷；加一抗4 ℃冰箱過夜，加二抗37 ℃下孵育30 min；AEC顯色，蘇木精復(fù)染，水溶性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陽性細(xì)胞染色呈黃色或棕褐色。

1.6Westernblot檢測大腸組織中IL-9蛋白的表達用預(yù)冷PBS洗滌2次后取30 mg大腸液氮下勻漿，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心5 min后取上清，BCA法測蛋白濃度。每孔加5 μL樣品，加山羊抗小鼠IL-9抗體(按1∶500稀釋)及兔抗小鼠β-tublin抗體(內(nèi)參，按1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫30 min，加HRP標(biāo)記的馬抗山羊抗體(按1∶200稀釋)、HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(按1∶10 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，曝光，采用圖像分析軟件Quantity One測定條帶灰度值，以目的條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用2×3析因設(shè)計的方差分析比較2組小鼠14、18、22周大腸組織IL-9表達水平的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1小鼠CAC模型的建立實驗組小鼠飲食減少，精神欠佳，體重增長小于對照組。肉眼觀察：對照組小鼠黏膜皺襞清晰可見，無糜爛、潰瘍等表現(xiàn)。實驗組小鼠14周可見結(jié)腸黏膜輕度充血、水腫，出現(xiàn)少量結(jié)節(jié)狀新生物；18周可見結(jié)腸黏膜彌漫性充血、水腫，結(jié)節(jié)狀新生物多見，且在距肛門4 cm處有較多聚集，遠(yuǎn)端結(jié)直腸黏膜可見直徑2～4 mm的隆起結(jié)節(jié)；22周可見結(jié)腸黏膜嚴(yán)重彌漫性充血、水腫，在距肛門2 cm處結(jié)節(jié)狀新生物增多，最大瘤體直徑大于14周。第14、18、22周，實驗組小鼠大腸腫瘤數(shù)目分別為(4.20±1.92)、(6.60±1.52)和(30.20±3.56)。

2.2免疫組化結(jié)果對照組：IL-9在腸組織上皮和間充質(zhì)細(xì)胞中少量表達(圖1A)；實驗組：由炎癥到癌前病變、癌腫發(fā)生過程(14～18周)中，IL-9表達逐步增加，主要表達于瘤變上皮組織(圖1B)，22周時，其在腫瘤間充質(zhì)中的表達也明顯增加(圖1C)。

A：正常組織；B：癌前病變；C：癌性病變；箭頭所指為陽性表達圖1 免疫組化結(jié)果(ABC, ×200)

2.3Westernblot結(jié)果實驗14、18、22周，實驗組小鼠大腸組織中IL-9的表達逐漸升高，且高于對照組。見圖2、表1。

1、3、5：分別為14周、18周和22周的實驗組；2、4、6：分別為14周、18周和22周的對照組

圖2 Western blot結(jié)果表1 2組小鼠不同時間點IL-9蛋白表達水平比較

F組間=198.975，F(xiàn)時間=851.306，F(xiàn)交互=34.476，P均<0.001

3 討論

流行病學(xué)證據(jù)[6]顯示我國近年來CRC發(fā)病率的快速增長與炎癥性腸病發(fā)病率的上升呈平行關(guān)系，提示炎癥性腸病可能是CRC發(fā)病的原因之一；此外，CAC在CRC中所占的比例也在不斷升高。有證據(jù)[7]表明，免疫因素失調(diào)導(dǎo)致炎癥的發(fā)展。因此，對免疫因素的研究有助于厘清CAC的發(fā)病機制。

IL-9主要由Th9細(xì)胞分泌并進行調(diào)節(jié)[8]，然而，其他Th細(xì)胞子集也似乎具有分泌IL-9的潛力。Th17細(xì)胞可分泌IL-9，長期Th17培養(yǎng)物具有共表達IL-17A和IL-9的能力[9]。Th9分泌的IL-9在一定程度上可以促進Th17細(xì)胞的分化[10]，而Th17細(xì)胞在UC中的促炎作用已獲共識[11]。Nalleweg等[12]研究發(fā)現(xiàn)IL-9 mRNA在人UC組織中的表達增加，并且IL-9對腸道炎癥的影響是由腸上皮細(xì)胞中過度表達的IL-9受體介導(dǎo)的。因此，靶向IL-9或IL-9受體信號可能是UC的潛在治療選擇。CRC的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及多個方面，其預(yù)防和治療一直是近年研究的重點。其中以腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)抗原多肽為靶抗原制備的CRC疫苗，在臨床應(yīng)用中的療效已經(jīng)得到證實，治療方案已經(jīng)從實驗階段邁向了臨床[13]。

本實驗成功構(gòu)建了小鼠CAC模型，為研究炎癥性腸病及CRC的發(fā)病機制提供了有效的工具。腸道病理結(jié)果表明，在DSS和DMH的持續(xù)作用下，14周時小鼠大腸組織出現(xiàn)癌前病變(低級別異型增生)，18周和22周時，病變不斷進展，形成高級別異型增生(癌變)，同時肉眼可見腫瘤數(shù)目也不斷增加；IL-9主要表達于結(jié)腸的上皮組織，并且隨著炎癥→異型增生(癌前病變)→癌順序的演變，表達量明顯增加。IL-9是一個強烈的促炎細(xì)胞因子，可促進腸道慢性炎癥的形成[14]，而慢性炎癥又是CAC發(fā)生最主要的驅(qū)動力量。我們研究組的最新結(jié)果[15]則顯示，IL-9抗體灌注可以阻斷IL-9信號、抑制腸道炎癥和實驗性UC的發(fā)生。因此，我們認(rèn)為IL-9可能參與了CAC的形成。

綜上所述，IL-9可能參與了小鼠CAC的發(fā)生發(fā)展。但本實驗局限于蛋白測定，未檢測組織中IL-9 mRNA的表達，而有關(guān)CAC形成的具體機制仍需要進一步的研究。