SLC22A12瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞模型的建立與鑒定

劉 亭，楊友輝，劉香香，馮 瑾，陳 雅，劉春花

1)貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴陽(yáng) 550004 2)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 貴陽(yáng) 550004 3)貴航貴陽(yáng)醫(yī)院藥劑科 貴陽(yáng) 550009

嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄受阻常常會(huì)引起高尿酸血癥，進(jìn)而可引起腎功能損傷以及痛風(fēng)等疾病[1]。嘌呤在體內(nèi)被黃嘌呤氧化酶氧化成尿酸，尿酸需要經(jīng)過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)、腎小管重吸收、腎小管再分泌及分泌后重吸收等過(guò)程排出體外[2]。尿酸排泄量受腎小管尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的種類(lèi)、活性及數(shù)量的影響，常見(jiàn)的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體包括尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(hUAT)和SLC22A12基因編碼的尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(hURAT1)[3]。尿酸鹽從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外需要hUAT的參與[4-5]，腎近端小管對(duì)尿酸鹽的重吸收及尿酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)主要靠hURAT1的作用，原尿中90%左右的尿酸是被hURAT1重吸收入血的[6-7]。目前臨床上治療尿酸血癥過(guò)高的藥物主要是通過(guò)抑制尿酸的合成及抑制黃嘌呤氧化還原酶的活性來(lái)降低尿酸的生成[8]，但這些藥物如苯溴馬隆、丙磺舒、別嘌醇等[9]常會(huì)引起胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損傷等毒副作用或者產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)、Stevens Johnson綜合征等嚴(yán)重不良反應(yīng)[10]，限制了其應(yīng)用。鑒于hURAT1在尿酸重吸收中的重要作用，其逐漸成為抗高尿酸藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。構(gòu)建一個(gè)體外尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞模型，成為抗高尿酸新藥篩選的迫切需要。目前所構(gòu)建的細(xì)胞模型多是采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法，雖然可以得到穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞株，但是時(shí)間、人力和資源花費(fèi)較多。作者首先構(gòu)建了SLC22A12重組質(zhì)粒，并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，構(gòu)建模型細(xì)胞SLC-HEK293，通過(guò)qRT-PCR、Western blot檢測(cè)模型細(xì)胞中SLC22A12 mRNA和hURAT1蛋白的表達(dá)量，并使用超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)考察其對(duì)尿酸鈉的攝取能力，確證模型是否建立成功。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器人胚腎細(xì)胞HEK293購(gòu)自中國(guó)生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，貨號(hào)GNHu43。SLC22A12基因(NM_144585.3)和BM無(wú)縫克隆試劑盒(批號(hào)CL116-01)由博邁德基因技術(shù)有限公司提供；GV142質(zhì)粒(批號(hào)V79020)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司；胰蛋白酶(批號(hào)25300-054)和DMEM高糖培養(yǎng)基(批號(hào)8778619)購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清(批號(hào)P30-3302)購(gòu)自PAN公司；FuGENE?6轉(zhuǎn)染試劑(批號(hào)0000254749)、MTS(批號(hào)G3582)和Eastep?Super總RNA提取試劑盒(批號(hào)7020001018)購(gòu)自Promega公司；PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)AK5301)、SYBR?Premix Ex TaqⅡ(批號(hào)A7005-1)購(gòu)自TaKaRa公司；PCR引物由生物工程上海股份有限公司合成；抗hURAT1抗體(批號(hào)ab198791)、抗GAPDH抗體(批號(hào)ab8245)及相應(yīng)二抗購(gòu)自Abcam公司。倒置熒光顯微鏡(型號(hào)TS100)購(gòu)自Nikon公司；凝膠成像儀(Syngene型號(hào))購(gòu)自G-BOX公司；凝膠分析軟件(版本號(hào)Quantity One 4.6.2)、電泳儀(型號(hào)PowerpacTMBasic)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)CFX96)購(gòu)自Bio-Rad公司；核酸蛋白紫外測(cè)定儀(型號(hào)BioMate 3S)、高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)Fresco17)購(gòu)自Thermo公司。

1.2質(zhì)粒GV142-SLC22A12的構(gòu)建與鑒定用Hind Ⅲ andEcoRⅠ 酶對(duì)GV142質(zhì)粒和SLC22A12片段雙酶切，切膠回收后用BM無(wú)縫克隆試劑盒將載體與SLC22A12連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TOP10菌株(批號(hào)C1210-1，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)，于37 ℃培養(yǎng)箱中、在含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h。挑取單克隆于含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)12 h。利用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，用Hind Ⅲ 和EcoRⅠ酶對(duì)其進(jìn)行雙酶切鑒定，并用10 g/L的瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。同時(shí)挑取陽(yáng)性克隆送檢測(cè)序。

1.3HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，用胰蛋白酶消化后按1∶4比例傳代。

1.4SLC22A12瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞條件的優(yōu)化

1.4.1 轉(zhuǎn)染比例的優(yōu)化 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞稀釋成1×105mL-1，以2 mL/孔接種于6孔板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞的融合度達(dá)70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取4支1.5 mL無(wú)核酸離心管，每管加入100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基后，再分別加入FuGENE?6 轉(zhuǎn)染試劑10、8、6、4 μL，混合均勻。靜置5 min后分別加入GV142-SLC22A12質(zhì)粒2 μg，使其轉(zhuǎn)染比例[試劑(μL)∶質(zhì)粒(μg)]分別為5∶1、4∶1、3∶1和2∶1，混合均勻靜置15 min。6孔板換液后，加入混合物，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強(qiáng)度。

1.4.2 質(zhì)粒量的優(yōu)化 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105mL-1，鋪6孔板，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到65%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染比例為3∶1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染條件：9 μL試劑∶3 μg質(zhì)粒、6 μL試劑∶2 μg質(zhì)粒和3 μL試劑∶1 μg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強(qiáng)度。

1.5細(xì)胞中SLC22A12mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞，分為兩組，分別轉(zhuǎn)染GV142空質(zhì)粒(HEK293組)和GV142-SLC22A12質(zhì)粒(SLC-HEK293組)。轉(zhuǎn)染24 h后，利用Eastep?Super總RNA提取試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA稀釋10倍后作為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系：模板cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各0.8 μL，SYBR?Premix Ex TaqⅡ10 μL，ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸60 s。SLC22A12上游引物5’-AGTCGGCACGATGGCTCCTC-3’,下游引物5’-CCGCATGGCTGAAAGCAAGA-3’;GAPDH上游引物5’-GGTCCTGGTTCTCATTCCT-3’,下游引物5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt方法計(jì)算目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6細(xì)胞中hURAT1蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)細(xì)胞分組和處理同1.5。轉(zhuǎn)染24 h后，裂解細(xì)胞，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，半干轉(zhuǎn)儀恒壓25 V轉(zhuǎn)膜30 min，封閉30 min，分別用抗hURAT1抗體(按1∶200稀釋)和抗GAPDH抗體(按1∶2 000稀釋)孵育1 h，洗膜后加入二抗(按1∶4 000稀釋)孵育1 h，洗膜后用ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantity One軟件分析灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算hURAT1和GAPDH條帶灰度值的比值。

1.7SLC-HEK293細(xì)胞功能的驗(yàn)證

1.7.1 尿酸鈉對(duì)SLC-HEK293細(xì)胞的安全濃度 參照Shin等[11]的方法，稍作調(diào)整。將SLC-HEK293和HEK293細(xì)胞接種于6孔板，分別用100、200、400、600、800和1 000 μmol/L的尿酸鈉(樣品組)于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。棄培養(yǎng)上清，用無(wú)血清培養(yǎng)基以100 μL/孔洗板2次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL和MTS 5 μL，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度(A)。以不加尿酸鈉的細(xì)胞作為對(duì)照組，以無(wú)血清培養(yǎng)基的A為背景值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(A樣品組-A背景值)/(A對(duì)照組-A背景值)×100%。

1.7.2 尿酸鈉攝取速率的測(cè)定 參照Shin等[11]的方法，稍作調(diào)整。將SLC-HEK293和HEK293細(xì)胞接種于6孔板，分別用10、20、40、80、160和320 μmol/L的尿酸鈉于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，PBS清洗2次后，用RIPA裂解細(xì)胞。取裂解液按1∶6的體積比加入甲醇沉淀蛋白，于4 ℃以12 000g離心30 min，取上清用UPLC-MS/MS測(cè)定兩種細(xì)胞對(duì)尿酸鈉的攝取速率[尿酸攝取總量/(蛋白總量·攝取時(shí)間)]。

1.7.3 色譜與質(zhì)譜條件 Waters Van Guard BEH C18色譜柱(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm)柱和保護(hù)柱(2. 1 mm × 50 mm，17 μm)；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣體積：2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈，B含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的水；梯度洗脫：10% B(0～2 min)，10%～90% B(1.5～4 min)，100% B(4～6 min)。質(zhì)譜采用選擇離子監(jiān)測(cè)(SIR)和電噴霧離子源(ESI)檢測(cè)。錐孔電壓為30 V、50 V；碰撞電壓分別為15 V、40 V，以5-氟尿嘧啶為內(nèi)標(biāo)用于定量正離子對(duì)(m/z)：166.8(尿酸鈉)，126.75(5-氟尿嘧啶)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行分析，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組細(xì)胞中SLC22A12 mRNA、hURAT蛋白水平的差異，應(yīng)用單因素方差分析比較不同濃度尿酸鈉對(duì)細(xì)胞存活率的影響，應(yīng)用2×6析因設(shè)計(jì)的方差分析比較兩組細(xì)胞對(duì)尿酸鈉攝取能力的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)粒GV142-SLC22A12的酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，重組質(zhì)粒的大小在7 kb左右，雙酶切后產(chǎn)生了2條條帶，1.6 kb為目的基因片段，5.4 kb為GV142載體片段，均與理論大小符合。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果顯示插入片段與目的基因序列一致。

M1、M2：DNA Marker；1：GV142-SLC22A12；2：雙酶切圖1 質(zhì)粒GV142-SLC22A12的鑒定

2.2轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

2.2.1 轉(zhuǎn)染比例的優(yōu)化 隨著轉(zhuǎn)染比例的增加，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度先增加后降低；當(dāng)轉(zhuǎn)染比例為3∶1時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)(圖2)，說(shuō)明3∶1為最佳轉(zhuǎn)染比例。

2.2.2 質(zhì)粒量的優(yōu)化 在轉(zhuǎn)染比例為3∶1條件下，隨著質(zhì)粒量的增加，綠色熒光強(qiáng)度先增加后減小；當(dāng)質(zhì)粒量為2 μg時(shí)，熒光強(qiáng)度最高(圖3)，說(shuō)明質(zhì)粒量為2 μg時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高。

2.3兩種細(xì)胞中SLC22A12mRNA和hURAT1蛋白的表達(dá)見(jiàn)表1。由表1可知，與HEK293相比，SLC-HEK293細(xì)胞中SLC22A12 mRNA和hURAT1蛋白的表達(dá)水平顯著增加(P<0.001)。

A：5∶1；B：4∶1；C：3∶1；D：2∶1圖2 不同轉(zhuǎn)染比例的轉(zhuǎn)染效果(×100)

A：3 μg；B：2 μg；C：1 μg圖3 試劑和質(zhì)粒不同用量的轉(zhuǎn)染效果(×100)

表1兩種細(xì)胞中SLC22A12mRNA和hURAT1蛋白的表達(dá)

組別nSLC22A12 mRNAhURAT1蛋白HEK29331.000±0.0330.194±0.022SLC-HEK2933152.190±19.1330.882±0.015t 13.68739.690P<0.001<0.001

2.4SLC-HEK293細(xì)胞的尿酸鈉攝取功能

2.4.1 不同濃度尿酸鈉對(duì)兩種細(xì)胞存活率的影響

見(jiàn)表2。當(dāng)尿酸鈉的濃度大于400 μmol/L時(shí)，尿酸鈉降低了SLC-HEK293細(xì)胞的存活率(P<0.05)。因而在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，尿酸鈉濃度均低于400 μmol/L。

2.4.2 兩種細(xì)胞對(duì)尿酸鈉攝取能力的比較 見(jiàn)表3。隨著尿酸鈉濃度的增加，HEK293和SLC-HEK293細(xì)胞對(duì)尿酸鈉攝取速率增加。和HEK293相比，SLC-HEK293細(xì)胞尿酸鈉攝取速率明顯增高(P<0.001)。

表2 不同濃度尿酸鈉對(duì)兩種細(xì)胞存活率的影響(n=6)

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05

表3 兩種細(xì)胞對(duì)尿酸鈉攝取能力的比較(n=3) nmol/(g·min)

F組別=4 695.610，F(xiàn)濃度=1 891.206，F(xiàn)交互=854.103，P均<0.001

3 討論

國(guó)內(nèi)高尿酸血癥發(fā)病率高, 但能有效用于降尿酸的藥物種類(lèi)較少，尤其是促尿酸排泄的藥物。雖然苯溴馬隆排尿酸效果明顯，但毒副作用大，具有嚴(yán)重的肝臟毒性[12-13]。迄今為止，美國(guó) FDA仍未批準(zhǔn)苯溴馬隆上市，但由于沒(méi)有更好的排尿酸藥物，我國(guó)臨床上仍在使用苯溴馬隆[11]。促尿酸排泄新藥的開(kāi)發(fā)，已經(jīng)成為一個(gè)緊迫的任務(wù)。

腎臟尿酸清除過(guò)低是90%的原發(fā)性高尿酸血癥的病因。研究[14]表明，SLC22A12基因編碼的hURAT1是腎小管上皮細(xì)胞最主要的尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體，抑制hURAT1活性將極大阻礙尿酸重吸收，從而促進(jìn)尿酸排泄；hURAT1也逐漸成為降尿酸藥物開(kāi)發(fā)的熱門(mén)靶點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)常用動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行排尿酸活性成分的篩選。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，用藥物量大，成本高，不適合用于活性成分的初篩。因此，為了加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，降低篩選成本，本文制備了一個(gè)SLC22A12瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞模型。

在細(xì)胞選擇上，常用的腎源細(xì)胞有犬腎細(xì)胞MDCK和人胚腎細(xì)胞HEK293。由于MDCK不是人源細(xì)胞，并且預(yù)實(shí)驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)MDCK細(xì)胞的消化時(shí)間較長(zhǎng)，且不容易制備成單個(gè)細(xì)胞，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。而HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)快、易消化，也容易被吹散為單個(gè)細(xì)胞，并且該細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率很高。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇了HEK293來(lái)構(gòu)建細(xì)胞模型。

在轉(zhuǎn)染方法的選擇上，常用的轉(zhuǎn)染方法一般分為病毒法和非病毒法。病毒法是以病毒為載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法，該方法具有易引起免疫原性、成本高、對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較高和插入細(xì)胞核中位置的不固定等缺點(diǎn)。非病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法中常用的有磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體法和非脂質(zhì)體法，其中非脂質(zhì)體法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染因具有高效低毒，無(wú)需去除血清或培養(yǎng)基，導(dǎo)入非脂質(zhì)體-DNA 復(fù)合物后也無(wú)需洗滌或更換培養(yǎng)基等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了非脂質(zhì)體制劑FuGENE介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。

從qRT-PCR和Western blot結(jié)果來(lái)看，SLC-HEK293細(xì)胞中SLC22A12 mRNA和hURAT1蛋白表達(dá)水平遠(yuǎn)高于HEK293細(xì)胞，說(shuō)明SLC22A12基因在SLC-HEK293中得到了高表達(dá)。尿酸鈉攝取實(shí)驗(yàn)表明，SLC-HEK293細(xì)胞的尿酸鈉攝取速率高于HEK293細(xì)胞，表明SLC-HEK293細(xì)胞中高表達(dá)的hURAT1蛋白能發(fā)揮正常功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功建立了SLC22A12瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞模型，該模型制備過(guò)程簡(jiǎn)單，易于操作，是促尿酸排泄有效成分篩選的一個(gè)便利工具。