MS-275對食管鱗癌KYSE-70細胞存活、細胞周期、凋亡及遷移的影響

劉騰飛，周建康，黃團結(jié)，王亞蘋，周馨魁，張 樂,張璐玉，陳一豪，劉紅濤，關(guān)方霞，馬珊珊

鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

食管癌是消化系統(tǒng)最普遍的惡性腫瘤之一，其病死率和發(fā)病率分別位居全國惡性腫瘤第4位和第5位[1]。尋找治療食管癌的分子靶向藥物迫在眉睫。MS-275是動物體內(nèi)具有口服抗癌活性且低毒的苯甲酰胺類組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDAC)抑制劑，屬于Ⅰ類HDAC抑制劑[2]。研究[3-8]發(fā)現(xiàn)，MS-275對肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等均展現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，且具有很強的特異性和選擇性。因此，MS-275是一種具有廣泛應用前景的抗腫瘤藥物，但是MS-275在食管鱗癌方面的研究較少。本研究旨在檢測MS-275對食管鱗癌KYSE-70細胞存活、凋亡、細胞周期以及遷移的影響，并分析其對PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白p-Akt1和p-mTOR表達的影響，以期為進一步研究MS-275對食管鱗癌的抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑正常食管上皮Het-1A細胞和食管鱗癌細胞株KYSE-70由鄭州大學第一附屬醫(yī)院細胞生物學實驗室保存，MS-275(美國Medchemexpress公司)，標準胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基及磷酸鹽緩沖液(以色列BI公司)，CCK-8(日本同仁公司)，凋亡檢測試劑盒(蘇州宇恒生物科技有限公司)，細胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基公司)，Transwell 小室(美國Corning 公司)。鼠抗人HDAC1抗體購自CST公司，鼠抗人p-Akt1抗體購自萬類生物科技(沈陽)有限公司，鼠抗人p-mTOR抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司，兔抗人Cyclin D1和E-cadherin抗體購自三鷹生物技術(shù)(武漢)有限公司。MS-275溶解于DMSO配制成50 mmol/L的儲存母液。

1.2細胞培養(yǎng)細胞均使用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5% 的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3HDAC1mRNA表達的檢測收集對數(shù)生長期的KYSE-70和Het-1A細胞，Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參檢測HDAC1 mRNA表達情況。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。引物序列見表1。實驗重復3次。目的基因相對表達量=2-ΔΔCt。

1.4CCK-8法檢測細胞存活情況收集對數(shù)生長期KYSE-70細胞并調(diào)整細胞濃度至7×104mL-1，接種于96孔板，每孔約7×103個細胞。待細胞貼壁后，分別加入0.00(對照)、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μmol/L MS-275，每組設(shè)3個復孔。細胞分別培養(yǎng)24、48和72 h后，更換為100 μL含體積分數(shù)10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，然后在避光條件下37 ℃孵育2 h，使用酶標儀檢測450 nm波長的吸光度(A)值。實驗重復3次。細胞存活率=(A對照孔-A實驗孔)/(A對照孔-A空白孔)×100%。

1.5細胞周期檢測按1.4方法處理細胞，分別加入0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 μmol/L MS-275。細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA 的胰酶消化細胞，離心棄上清，PBS洗滌，加入體積分數(shù)70%的冷乙醇500 μL，4 ℃固定4～6 h，然后加入100 μL RNase A，37 ℃下水浴30 min，再加入400 μL PI染色，4 ℃避光30 min，最后上流式細胞儀檢測。每組設(shè)3個復孔。

1.6細胞凋亡檢測按1.5分組處理KYSE-70細胞，用不含EDTA 的胰酶消化細胞，離心棄上清，PBS洗滌2次，再加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，然后按照要求加入Annexin V-FITC和PI，室溫避光條件下反應5～15 min，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。每組設(shè)3個復孔。

1.7細胞遷移檢測接種細胞前在6孔板背面畫幾條橫線作標記，然后收集對數(shù)生長期的KYSE-70細胞，接種于6孔板中，每孔細胞融合度應在12～24 h達到90%以上。細胞鋪滿孔板底面后，用200 μL移液器槍頭垂直于孔板底面的橫線制造劃痕，這個過程中盡量使每個劃痕寬度一致。劃痕結(jié)束后吸棄細胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，加入用無血清培養(yǎng)基配制的濃度分別為0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 μmol/L MS-275，置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并于0、48 h進行取樣拍照。實驗重復3次。劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-48 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.8Westernblot檢測相關(guān)蛋白的表達細胞分組及培養(yǎng)同1.5。采用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，使用BCA法測蛋白濃度后，加入5×Loading Buffer，100 ℃變性10 min，于-80 ℃保存。采用SDS-PAGE進行蛋白質(zhì)分離，每孔上樣量為50～200 μg，然后依次經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗(p-mTOR按1∶200稀釋，Cleaved caspase-3和p-Akt1按1∶500稀釋，E-cadherin按1∶1 000稀釋，β-actin和Cyclin D1按1∶2 000稀釋)、洗滌、孵育二抗、洗滌和曝光，最后用Image J軟件進行灰度分析，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.9統(tǒng)計學處理應用SPSS 19.0分析。采用3×6析因設(shè)計的方差分析不同濃度MS-275作用不同時間對KYSE-70細胞存活的影響，應用兩獨立樣本t檢驗比較Het-1A和KYSE-70細胞中HDAC1 mRNA和蛋白表達的差異，應用單因素方差分析比較各組細胞周期、凋亡、遷移情況以及相關(guān)蛋白表達的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1Het-1A和KYSE-70細胞中HDAC1mRNA和蛋白的表達結(jié)果見表2。

表2 Het-1A和KYSE-70細胞中HDAC1的表達

2.2MS-275對KYSE-70細胞存活的影響結(jié)果見表3。隨著MS-275濃度的增加，細胞存活率降低，處理時間越長，細胞存活率越低。MS-275對KYSE-70細胞存活的影響具有時間和劑量依賴性。后續(xù)實驗中選擇作用時間為48 h，作用濃度分別為0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 μmol/L。

2.3MS-275對KYSE-70細胞細胞周期、凋亡和遷移的影響結(jié)果見表4。隨著MS-275濃度的增加，各組G0/G1期細胞所占比例均顯著增加，S期細胞所占比例減少；細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯增加；劃痕愈合率均顯著減少(P<0.05)。

2.4MS-275對KYSE-70細胞細胞周期、凋亡和遷移相關(guān)蛋白表達的影響結(jié)果見圖1和表5。隨著MS-275濃度的增加，各組細胞中Cyclin D1蛋白表達量降低，而Cleaved caspase-3、E-cadherin蛋白表達增加(P<0.05)。

2.5MS-275對KYSE-70細胞中p-Akt1和p-mTOR蛋白表達的影響結(jié)果見圖2和表5。隨著MS-275濃度的增加，各組細胞中p-Akt1、p-mTOR蛋白表達均明顯降低(P<0.05)。

表3 MS-275對KYSE-70細胞存活率的影響(n=3) %

F時間=399.073,F濃度=402.922,F交互=17.495,P均<0.001

表4 MS-275對KYSE-70細胞周期、凋亡和遷移的影響(n=3) %

*:組間兩兩比較，P均<0.05

1、2、3、4、5：分別為0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 μmol/L MS-275

圖1各組細胞中CyclinD1、

Cleavedcaspase-3和E-cadherin蛋白的表達

1、2、3、4、5：分別為0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 μmol/L MS-275

圖2 各組細胞中p-Akt1、p-mTOR蛋白的表達表5 各組KYSE-70細胞中Cyclin D1、Cleaved caspase-3、E-cadherin、p-Akt1和p-mTOR蛋白表達水平的比較(n=3)

*:與0.00 μmol/L組比較，P<0.05；#：與0.25 μmol/L組比較，P<0.05；△：與0.50 μmol/L組比較，P<0.05；▲：與1.00 μmol/L組比較，P<0.05

3 討論

腫瘤的發(fā)生與基因的表達異常密切相關(guān)。組蛋白的乙?；腿ヒ阴；钦{(diào)節(jié)基因表達平衡的重要因素，如果平衡被打破就會導致腫瘤的發(fā)生。HDAC1 在腎細胞癌、卵巢癌、膽管癌、宮頸癌等多種癌癥中表達上調(diào)，而干擾HDAC1 能夠影響癌細胞的生長[9-11]。本研究表明，與Het-1A細胞相比，KYSE-70細胞中HDAC1 mRNA和蛋白表達均明顯增多。MS-275可通過抑制HDAC，提高腫瘤細胞中組蛋白的乙?；潭龋谷旧|(zhì)處于相對松弛的狀態(tài)，從而易于轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合而促進轉(zhuǎn)錄，隨后激活細胞的多條信號轉(zhuǎn)導通路，誘導特定基因表達，最終發(fā)揮腫瘤抑制作用。

MS-275對淋巴瘤細胞系有明顯的抑制作用，而且這種抑制作用隨MS-275的濃度和時間的增加而升高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)MS-275可有效抑制KYSE-70細胞的增殖，并具有時間和劑量依賴性。目前MS-275與阿扎胞苷聯(lián)用治療非小細胞肺癌、黑素瘤等各種實體瘤已進入Ⅱ期臨床試驗階段，而在乳腺癌的治療方面MS-275和依西美坦聯(lián)合用藥已進入了Ⅲ期臨床試驗[13]。目前認為MS-275在淋巴癌、乳腺癌等細胞中的抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期和抑制細胞遷移。MS-275的抗腫瘤作用機制存在多個方面。MS-275誘導細胞凋亡可以說是對惡性腫瘤的普遍應答。研究[14]顯示，MS-275能強烈誘導肝癌中Caspase-3剪切體的表達，并在一定程度上還能激活Caspase-8。MS-275可增強黑色素瘤細胞對TNF相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL)的敏感性[15]。MS-275的另一種常見細胞反應是阻滯細胞周期。p21Waf1/Cip1對細胞周期進程具有抑制作用，研究[16]表明MS-275能明顯上調(diào)其在肝癌細胞中的表達。MS-275能通過下調(diào)Cyclin D1的表達水平來阻滯白血病細胞的細胞周期，此外還能通過增強細胞中E-cadherin的表達，從而達到抑制其遷移的目的[17]。本研究顯示MS-275可以降低KYSE-70細胞的存活率，抑制細胞遷移，阻滯細胞于G0/G1期并誘導細胞凋亡。Western blot 結(jié)果顯示MS-275可顯著提高Cleaved caspase-3和E-cadherin蛋白的表達，降低Cyclin D1蛋白的表達。PI3K/Akt/mTOR信號通路作為細胞內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導途徑，在細胞的生長、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學功能，該通路的紊亂會引起包括癌癥在內(nèi)的一系列的疾病[18-19]。因此，作者進一步檢測了MS-275對PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白p-Akt1和p-mTOR表達的影響，結(jié)果表明，p-Akt1和p-mTOR蛋白的表達量隨著MS-275濃度的增加而呈現(xiàn)明顯降低的趨勢，提示MS-275對KYSE-70細胞發(fā)揮抗腫瘤作用可能是通過PI3K/Akt/mTOR信號通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，該研究表明MS-275可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路來發(fā)揮對KYSE-70細胞的抗腫瘤作用。該研究為下一步通過體內(nèi)實驗進行系統(tǒng)分析MS-275對食管癌的抗腫瘤作用奠定了基礎(chǔ)。