實(shí)驗(yàn)用西藏小型豬CYP3A46基因擴(kuò)增梯度PCR方法的建立

盧康榮　白靜　張嘉寧　謝水林　顧為望　黃黎珍　王萬(wàn)山

【摘 要】目的：建立西藏小型豬CYP3A基因梯度PCR擴(kuò)增方法。方法：以西藏小型豬肝臟總cDNA為模板，基于CYP3A46基因引物，對(duì)CYP3A46進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增（設(shè)計(jì)溫度梯度55-65℃）。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得特異性好的最佳退火溫度。結(jié)果：各退火溫度均能特異的擴(kuò)增出1500bp左右的目的條帶。結(jié)論：本反應(yīng)體系及各溫度梯度均可特異性擴(kuò)增西藏小型豬CYP3A46基因，為進(jìn)一步克隆表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞色素P450酶；西藏小型豬；克隆

中圖分類(lèi)號(hào)： Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2018）19-0088-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.19.039

Establishment of gradient PCR amplification method for CYP3A46 gene of laboratory Tibet minipigs

LU Kang-rong1 BAI Jing2 ZHANG Jia-ning3 XIE Shui-lin2 GU Wei-wang3 HUANGLi-zhen2 WANG Wan-shan3*

（1.Basic Medical College of Southern Medical University， Guangzhou Guangdong 510515， China；2.School of Bioscience and Bioengineering， South China University of Technology， Guangzhou Guangdong 510006， China；3.Laboratory Animal Service Center， Southern Medical University， Guangzhou Guangdong 510515， China）

【Abstract】Objective： Establishing gradient PCR amplification method for CYP3A46 gene of Tibet minipigs. Methods： Based on CYP3A46 primers， using total cDNA of Tibet minipig liver as template， CYP3A46 was amplified by gradient PCR， temperature gradients were set as 55-65℃. PCR fragments was checked by DNA agarose gel electrophoresis， trying to get the best annealing temperature. Results： A specific band of 1500 bp corresponding to the target band could be amplified by any temperature from 55 to 65℃. Conclusions： CYP3A46 gene of Tibet minipigs could be specifically amplified by this reaction system and temperature gradients， laying a foundation for the further cloning and expression.

【Key words】Cytochrome P450 enzyme；Tibet minipig；Clone

由于與人在解剖、生理生化等方面有極大相似性，小型豬在人類(lèi)疾病動(dòng)物模型、器官移植、新藥研發(fā)等領(lǐng)域的研究日益廣泛，已成為除靈長(zhǎng)類(lèi)和犬以外唯一被FDA推薦的臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1-2]。小型豬是人類(lèi)藥物代謝（尤其是CYP3A途徑代謝類(lèi)藥物）的重要模型動(dòng)物，但其細(xì)胞色素 P450 的研究大大落后于人及大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。國(guó)外的研究主要集中在 Goettingen和Yucantan小型豬上，國(guó)內(nèi)對(duì)小型豬細(xì)胞色素 P450 的研究?jī)H在巴馬小型豬和貴州小型豬有少量報(bào)道[3-4]。實(shí)驗(yàn)用西藏小型豬已在生物醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但是關(guān)于其P450酶系研究尚屬空白[5]，本研究擬建立西藏小型豬CYP3A46基因梯度PCR擴(kuò)增技術(shù)方法，為進(jìn)一步的克隆表達(dá)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

6月齡成年西藏小型豬肝臟組織置液氮中保存，Trizol總RNA抽提試劑（GIBCO）， PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker購(gòu)于天根公司；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純或常規(guī)生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genebank中基因序列CYP3A46（NM_001134824），設(shè)計(jì)合成正向引物Scyp3a46-F：5'gtggc catgg acctg atccc3'；反向引物Scyp3a46-R：5'aagtc aggct ccact tgtgg3'。引物送英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 西藏小型豬肝臟總cDNA的制備

TRIZOL 法提總RNA。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作規(guī)程進(jìn)行西藏小型豬肝臟總cDNA的制備。

1.2.3 西藏小型豬CYP3A46基因編碼序列的梯度PCR擴(kuò)增

應(yīng)用梯度PCR進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化：反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)程序：預(yù)變性98℃ 5min；98℃ 10s，52-62℃ 15s，72℃ 20s；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，最后4℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及片段膠回收

將5μL DNA MarkerⅢ、PCR產(chǎn)物和5μL6×Loading Buffer全部置于1%瓊脂糖凝膠，200V恒壓電泳20min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外激發(fā)光下觀察片段大小。

2 結(jié)果

選擇引物CYP3AF和CYP3A46R，對(duì)CYP3A46進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增（設(shè)計(jì)溫度梯度55-65℃），以期找出最佳擴(kuò)增條件。結(jié)果見(jiàn)圖1，表明各退火溫度均能特異的擴(kuò)增出1500bp左右的目的條帶。

3 討論

藥物在豬體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化與人極為相似，是非臨床安全性評(píng)價(jià)的良好模型。加之小型豬飼養(yǎng)成本低，操作簡(jiǎn)便，因此小型豬應(yīng)用于新藥開(kāi)發(fā)研究已成為國(guó)際范圍內(nèi)的焦點(diǎn)。國(guó)外小型豬資源匱乏，我國(guó)小型豬品種資源豐富[6]。但是國(guó)外尤其是歐洲的G？觟ttingen小型豬已在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，尤其是藥理、毒理等新藥研發(fā)領(lǐng)域[7]。我國(guó)小型豬資源開(kāi)發(fā)水平與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家比較仍有較大差距。西藏小型豬是從西藏引進(jìn)，在廣州地區(qū)進(jìn)行風(fēng)土馴化及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的小型豬豬種，該小型豬具備抗疾病能力強(qiáng)、應(yīng)激反應(yīng)小、術(shù)后愈合快等優(yōu)點(diǎn)，是非常有特色的實(shí)驗(yàn)小型豬[8]。

I相藥物代謝酶-細(xì)胞色素P450酶系（CYPs）在眾多外來(lái)化合物（包括藥物）的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中扮演了重要角色， 據(jù)估計(jì)60%普通處方藥需要通過(guò)細(xì)胞色素P450系統(tǒng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，催化的底物廣泛，是人體內(nèi)最主要的代謝酶，在藥理學(xué)、毒理學(xué)研究中有著重要的意義[9]。有研究表明小型豬1A、2E、3A、4A等具體亞型可作為藥物代謝模型。小型豬與人CYP3A的序列同源性較高，關(guān)于其亞族中的CYP3A29研究最多，該酶為人CYP3A4在豬體內(nèi)的同源酶。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于小型豬各亞型CYP酶的藥物代謝特征報(bào)道甚少[10]。國(guó)內(nèi)有報(bào)道貴州小型香豬肝微粒體CYP酶主要亞型的反應(yīng)活性，與人肝微粒體的活性相近，并呈現(xiàn)出與人相應(yīng)酶特異性抑制劑的抑制反應(yīng)活性[11]。楊家大等報(bào)道巴馬小型豬、貴州小型香豬肝臟CYP3A29 mRNA表達(dá)水平與人CYP3A4相近[12]。

鑒于關(guān)于西藏小型豬的CYP酶特性研究目前尚屬空白，為了克隆西藏小型豬相關(guān)CYP基因進(jìn)行深入研究，本實(shí)驗(yàn)基于梯度PCR技術(shù)，摸索PCR擴(kuò)增西藏小型豬CYP3A46的最佳退火溫度和反應(yīng)條件。研究結(jié)果表明，55-65℃范圍內(nèi)的各退火溫度均能特異的擴(kuò)增出1500bp左右的目的條帶，各溫蒂條件下擴(kuò)增效果類(lèi)似，說(shuō)明該反應(yīng)體系和退火溫度條件適于進(jìn)行西藏小型豬CYP3A基因的克隆擴(kuò)增，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Stricker-Krongrad A， Shoemake CR， Liu J， et al. The importance of minipigs in dermal safety assessment： an overview[J]. Cutan Ocul Toxicol. 2017；36（2）：105-113.

[2]Helke KL，Nelson KN，Sargeant AM，et al.Pigs in Toxicology：Breed Differences in Metabolism and Background Findings[J]. Toxicol Pathol.2016；44（4）：575-90.

[3]薛正楷，魏泓，商海濤，葉彬.CYP3A29穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞株的建立及其硝苯地平代謝活性鑒定[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2009，25：640-644.

[4]Yao M，Dai M，Liu Z，et al. Comparison of the substrate kinetics of pig CYP3A29 with pig fiver microsomes and human CYP3A4[J].Biosci Rep 2011.31：211-220.

[5]Liu W， Wu LH， Yue M， et al.Generation of DKK1 transgenic Tibet minipigs by somatic cell nuclear transfer （SCNT） [J]. Oncotarget. 2017；8（43）：74331-74339.

[6]鄒迪莎，于健.巴馬小型豬動(dòng)物模型在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2017，4：1128-1134.

[7]Descotes J，Allais L， Ancian P， et al. Nonclinical evaluation of immunological safety in G？ttingen Minipigs： The CONFIRM initiative[J].Regul Toxicol Pharmacol， 2018，94：271-275.

[8]廖潔丹，林連蓬，梁楚瑤，楊權(quán)，羅怡，等.廣東西藏小型豬血液生理生化指標(biāo)的分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2017，11：121-123.

[9]Millecam J， De Clerck L， Govaert E. et al. The Ontogeny of Cytochrome P450 Enzyme Activity and Protein Abundance in Conventional Pigs in Support of Preclinical Pediatric Drug Research[J]. Front Pharmacol. 2018： 14；9：470.

[10]蔡毅，盧康榮，陳妙良，等.實(shí)驗(yàn)用小型豬細(xì)胞色素P450酶研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014：35（6）：123-126.

[11]Shang H， Guo K， Liu Y， et al. Constitutive expression of CYP3A mRNA in Bama miniature pig tissues[J].Gene.2013： 25；524（2）：261-7.

[12]楊家大，商海濤，魏泓，等.實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬肝臟CYP3A29mRNA表達(dá)水平[J].遺傳，2007：29（5）：575-580.