持續(xù)光照后雌性大鼠正中隆起室管膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變

秦 永 郝慶卯,2△

(1 河北中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像教研室, 2 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點實驗室, 石家莊 050200)

據(jù)報道,全球不孕癥的發(fā)病率高達(dá)15%[1],我國不孕癥的發(fā)病率達(dá)7%～10%[2],并且不孕癥的發(fā)病率有逐年增高的趨勢。有多種原因可以導(dǎo)致不育癥,有研究表明,持續(xù)長時間光照可使大鼠動情周期延長、變得不規(guī)則,最終將導(dǎo)致雌性大鼠停止排卵[3-4],并可引起多囊卵巢[5]。生殖功能的調(diào)節(jié)依靠下丘腦-垂體-性腺軸。正中隆起位于第三腦室底部,介于下丘腦與垂體之間,下丘腦的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)神經(jīng)元及促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone, GnIH))神經(jīng)元合成的激素通過其分布在正中隆起神經(jīng)末梢將其釋放到正中隆起,然后通過垂體門靜脈系統(tǒng)將其輸送到腺垂體,從而來調(diào)節(jié)腺垂體激素的分泌活動[6]。持續(xù)光照后正中隆起室管膜的超微結(jié)構(gòu)改變國內(nèi)外未見報道,因此,研究持續(xù)光照后正中隆起超微結(jié)構(gòu)的改變對于揭示持續(xù)光照后所致生殖功能障礙的發(fā)病機制具有一定的意義。

1 材料和方法

1.1 動物模型制備與分組

SD雌性大鼠,2月齡,持續(xù)光照實驗前通過陰道涂片法篩選出動情周期至少穩(wěn)定2周后的動物8只。將實驗動物隨即分為2組,每組4只,實驗組用人工光照24h光照,光照強度控制在300LUX。對照組用同樣的光強度,7：30～19：30光照,19：30～7：30黑暗。80d后處死動物。

1.2 掃描電鏡標(biāo)本制備

參照呂佩源[7]及楊靖[8]方法制備掃描電鏡標(biāo)本。動物麻醉后,經(jīng)左心室快速灌注37℃的生理鹽水200～250ml,之后灌注固定液(含2%多聚甲醛和2．5%戊二醛)350ml。灌注完畢后取腦,放入2.5%戊二醛中后固定。將腦腹面朝上,在視交叉兩側(cè)各1mm平行做兩道矢狀切口向后延伸至漏斗柄,在視交叉前和漏斗柄后做一冠狀切口,在距離腦底面2mm處做一平行切口,在水平切面上可看到一裂隙即為第三腦室,從第三腦室裂隙可以在掃描電鏡下看到第三腦室底,即為正中隆起。將樣品塊放入磷酸緩沖液中過夜,系列梯度乙醇脫水,叔丁醇置換,二氧化碳臨界點干燥,SB-12型離子濺射儀真空噴金,日立S-3500N掃描電子顯微鏡觀察、照像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

對照組： 正中隆起位于第三腦室底壁上,介于視交叉與漏斗柄之間(圖1)。高倍鏡顯示正中隆起尾端為無纖毛區(qū),室管膜細(xì)胞界限清楚,大部分細(xì)胞表面平坦,微絨毛稀少;部分細(xì)胞表面輕微隆起,有密集的微絨毛;少部分細(xì)胞表面及細(xì)胞之間有小的開口樣表現(xiàn)。部分區(qū)域有直徑0.2～0.4μm密集的顆粒狀結(jié)構(gòu)(圖2)。正中隆起中部室管膜細(xì)胞表面膨隆,微絨毛密集,并可見大小不一的碟狀凹陷及散在的直徑8～15μm(73.84±3.29個/100μm2)的球狀結(jié)構(gòu),球狀結(jié)構(gòu)表面可見呈網(wǎng)狀分布的串珠狀纖維結(jié)構(gòu)(圖3)。正中隆起頭端室管膜細(xì)胞大小不一(5～10μm),大部分細(xì)胞輕度膨隆,細(xì)胞表面有微絨毛結(jié)構(gòu),部分細(xì)胞周邊有稀少的纖毛結(jié)構(gòu),室管膜細(xì)胞表面可見大量散在分布的直徑1～5μm(169.56±13.44個/100μm2)球狀結(jié)構(gòu),大部分球狀顆粒表面光滑、飽滿,部分有輕度皺縮,室管膜表面可見交織走形的纖維(圖4、5)。

實驗組： 正中隆起尾端無纖毛區(qū)細(xì)胞界限不清,表面微絨毛稀少,未見分泌顆粒。正中隆起中部細(xì)胞表面輕度膨隆,大部分細(xì)胞表面可見密集分布的微絨毛結(jié)構(gòu)及少量纖毛,表面有少量散在分布的直徑1～2μm(19.21±1.72個/100μm2)的顆粒狀結(jié)構(gòu)(圖6),部分區(qū)域有淤泥樣改變,細(xì)胞表面纖毛倒伏(圖7)。正中隆起頭端大部分細(xì)胞表面有豐富的纖毛結(jié)構(gòu),纖毛成束狀黏連在一起,少部分細(xì)胞表面只有微絨毛結(jié)構(gòu),細(xì)胞表面罕見顆粒狀結(jié)構(gòu)(4.46±1.28個/100μm2)(圖8)。室管膜表面纖維結(jié)構(gòu)稀少或斷裂。實驗組與對照組室管膜細(xì)胞上顆粒數(shù)量比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

正中隆起室管膜面結(jié)構(gòu)取決于性周期的變化,在動情期室管膜呈現(xiàn)高分泌狀態(tài),在動情前期室管膜表面吸收及分泌幾乎是均等的,在動情間期室管膜吸收現(xiàn)象很普遍[9]。動情前期正中隆起分泌顆粒明顯多于動情間期[10]。

本研究結(jié)果顯示,持續(xù)光照組正中隆起室管膜細(xì)胞的分泌顆粒明顯少于對照組,持續(xù)光照組帶有細(xì)胞纖毛明顯增多,說明持續(xù)光照可導(dǎo)致正中隆起室管膜分泌功能明顯降低。另外,持續(xù)關(guān)照后正中隆起室管膜細(xì)胞界限不清,室管膜上纖維明顯減少或斷裂,可能由于持續(xù)光照后正中隆起室管膜細(xì)胞及室管膜上結(jié)構(gòu)的損傷所致。

正常狀態(tài)下,光照刺激作用于視網(wǎng)膜,通過視神經(jīng)-視交叉上核-下丘腦室周核-交感神經(jīng)元,交感神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素作用于位于松果體腺細(xì)胞上的腎上腺能受體使褪黑素合成并釋放。褪黑素刺激下丘腦的GnIH神經(jīng)元,GnIH在下丘腦及正中隆起水平抑制GnRH神經(jīng)元的釋放[11],在下丘腦、垂體、性腺3個水平均有褪黑素受體,因此,褪黑素即可減少下丘腦GnRH釋放,垂體促性腺激素的釋放,又可減少性腺性激素的釋放[12]。由此推測,持續(xù)光照使褪黑素持續(xù)分泌,從而抑制了GnRH在正中隆起的釋放。

有研究表明,持續(xù)光照可抑制GnRH配體及受體在下丘腦及垂體的表達(dá)[13],下丘腦的GnRH細(xì)胞數(shù)量減少[14],垂體分泌的促性腺激素明顯降低[15],抑制了垂體促性腺激素[16]及卵巢促性腺激素受體[17]在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。

圖1 對照組正中隆起。A頭端;B中部;C尾端。標(biāo)尺=200μm.圖2 對照組尾端無纖毛區(qū)部放大,室管膜細(xì)胞表面平坦,界限清楚,表面可見細(xì)顆粒狀分泌物。標(biāo)尺=30μm.圖3 對照組正中隆起中部,分泌顆粒及碟狀凹陷。標(biāo)尺=20μm.圖4 對照組正中隆起頭端,大量散在的分泌顆粒及室管膜上纖維。標(biāo)尺=50μm.圖5 對照組正中隆起頭端,無纖毛細(xì)胞,少量纖毛的細(xì)胞及分泌顆粒。標(biāo)尺=10μm.圖6 實驗組正中隆起中部,密集的微絨毛室管膜細(xì)胞和少量分泌顆粒。標(biāo)尺=5μm.圖7 實驗組正中隆起中部,室管膜細(xì)胞表面淤泥樣結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺=10μm.圖8 實驗組正中隆起頭端,纖毛細(xì)胞和無纖毛細(xì)胞。標(biāo)尺=10μm.

持續(xù)光照后正中隆起室管膜的改變與持續(xù)光照后生殖功能的改變之間的關(guān)系應(yīng)進(jìn)一步探討。