內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-ATF4-CHOP信號(hào)通路參與慢性應(yīng)激大鼠下丘腦神經(jīng)細(xì)胞損傷

史為博 易善勇 王 賀 牛世霸 王松軍 李英敏 叢 斌

(河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系, 河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北省法醫(yī)分子鑒定協(xié)同創(chuàng)新中心, 石家莊 050017)

應(yīng)激是機(jī)體通過(guò)神經(jīng)、內(nèi)分泌以及其他系統(tǒng)共同參與和調(diào)節(jié)來(lái)應(yīng)對(duì)危險(xiǎn)而做出的綜合反應(yīng)[1]。機(jī)體通過(guò)適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)各系統(tǒng)代謝水平,增加其內(nèi)穩(wěn)態(tài)的能力,從而有效的減少危險(xiǎn)因素對(duì)機(jī)體造成的影響[2]。但是過(guò)度應(yīng)激可造成機(jī)體的損傷,影響機(jī)體的正常心理和生理功能[3]。普遍認(rèn)為下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA軸)在機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)中起著核心作用。目前研究表明,長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)激可以導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)不同程度的病理性損傷[4]。但是在應(yīng)激過(guò)程中下丘腦神經(jīng)細(xì)胞是否發(fā)生病理性改變,目前未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。外界刺激可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)紊亂,導(dǎo)致未折疊或者錯(cuò)誤折疊蛋白聚集以及病理過(guò)程,即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[5]。當(dāng)ERS持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者過(guò)強(qiáng)時(shí),可通過(guò)激活下游信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[6]。但是機(jī)體在應(yīng)激過(guò)程中,下丘腦神經(jīng)細(xì)胞是否發(fā)生了損傷從而影響HPA軸的功能以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化的雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)信號(hào)通路是否參與了這一損傷過(guò)程,目前的研究不夠詳盡。因此本研究在成功建立不同時(shí)程應(yīng)激大鼠模型的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)觀察糖皮質(zhì)激素水平變化、下丘腦組織病理學(xué)改變以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用健康成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量250g±20g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下,12h晝夜循環(huán),恒溫25℃,自由進(jìn)食水。本研究遵循河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)指導(dǎo)原則,所有處理盡量減少動(dòng)物使用量,減輕動(dòng)物的痛苦。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為以下組別： 1、3、7、14、21d束縛加冰水游泳組(RS+IS group)以及相應(yīng)對(duì)照組,每組6只。

1.2 主要試劑和儀器

ELISA試劑盒(上海藍(lán)基化學(xué)試劑有限公司);硫堇粉末(Alfa Aesar(天津)化學(xué)有限公司);兔來(lái)源糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)多克隆抗體、兔來(lái)源CHOP(生長(zhǎng)抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因153,growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153, GADD153)多克隆抗體、兔來(lái)源激活作用轉(zhuǎn)錄因子4(artificial transcription factor 4, ATF4)多克隆抗體;全景細(xì)胞組織定量分析系統(tǒng)(MMTC)(Tissue Gnostics中國(guó))。

1.3 建立應(yīng)激模型

模型是參照前期研究[7]改良而來(lái),采用將大鼠仰臥位固定每天8h(8：00～16：00)的束縛處理,同時(shí)禁食水,束縛結(jié)束后進(jìn)行5min冰水游泳。應(yīng)激各組進(jìn)行束縛處理時(shí),正常對(duì)照組大鼠于飼養(yǎng)籠中,同樣禁食水8h,其余時(shí)間各組大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法

經(jīng)腹主動(dòng)脈取血保留血清。向準(zhǔn)備好的反應(yīng)孔中加樣,37℃孵育1h,洗滌;加入酶標(biāo)抗體,37℃孵育0.5h,洗滌;加入底物顯色液,37℃孵育20min;終止反應(yīng),處理結(jié)果。

1.5 組織處理

根據(jù)George Paxinos大鼠腦立體定位圖譜[8],在大鼠頭顱冠狀位距前囟-1.80mm處準(zhǔn)確切取下丘腦位置,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。多聚賴氨酸處理玻片,連續(xù)石蠟切片(5μm)。

1.6 硫堇染色方法

石蠟切片置于60℃烤箱1h,常規(guī)脫蠟、水化,浸入0.5%硫堇溶液25s,水洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.7 免疫組織化學(xué)顯色

石蠟切片60℃烘干1h,常規(guī)脫蠟、水化組織切片,微波抗原修復(fù)97℃,冷卻至室溫;甲醇H2O2(5% H2O2)處理20min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,山羊血清封閉30min,滴加一抗(GRP78多克隆抗體,1∶200,ATF4多克隆抗體,1∶100,CHOP多克隆抗體,1∶200),濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜;加入二抗(生物素標(biāo)記山羊抗鼠IgG);加入堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素;DAB顯色;水溶性封片劑封片,普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.8 細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 糖皮質(zhì)激素水平變化

與正常對(duì)照組相比,應(yīng)激組大鼠血清中糖皮質(zhì)激素水平從第3天開始顯著性增高,7d達(dá)到高峰,14d維持在較高水平,但21d時(shí)糖皮質(zhì)激素水平顯著性降低,但與正常對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(圖1)。

圖1 不同時(shí)程應(yīng)激對(duì)血清糖皮質(zhì)激素濃度的影響

2.2 下丘腦神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)變化

正常對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,尼氏體均勻分布于胞質(zhì)內(nèi)。應(yīng)激1d組和3d組,尼氏體無(wú)明顯變化;隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),7d組下丘腦部分神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生水腫,尼氏體結(jié)構(gòu)不清;14d組部分細(xì)胞內(nèi)尼氏體消失,神經(jīng)細(xì)胞固縮濃染,21d組與14d組相比上述病理性改變更為明顯(圖2)。

2.3 GRP78、ATF4、CHOP的表達(dá)變化

GRP78、ATF4、CHOP均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)合MMTC分析系統(tǒng)，GRP78在1d時(shí)(21.15±2.80)開始顯著性增高(P<0.05),3d(40.02±3.14)達(dá)到高峰(P<0.01),7d(24.10±1.97)維持在較高水平(P<0.01),14d(6.13±0.85)顯著性降低,且與正常對(duì)照組(6.13±1.35)相比無(wú)明顯差異(P>0.05),21d(3.51±0.56)時(shí)與正常對(duì)照組相比明顯減少(P<0.05)(圖3)。ATF4在1d(11.34±1.85)、3d(22.89±2.18)、7d(28.66±2.42)、14d(26.60±2.29)以及21d(22.69±1.97)時(shí)均比正常對(duì)照組(6.80±1.64)顯著性增高(P<0.05),且7d達(dá)到高峰(圖4)。CHOP在應(yīng)激1d時(shí)(3.07±1.58)與正常對(duì)照組(2.92±1.65)相比無(wú)增加(P>0.05),隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),應(yīng)激3d(13.14±2.48)和7d(21.03±3.31)明顯增高(P<0.01),14d(45.55±3.31)達(dá)到高峰(P<0.01),21d(28.33±3.56)維持在較高水平(P<0.01)(圖5)。

圖2 不同時(shí)程應(yīng)激大鼠下丘腦硫堇染色。A’～F’： 分別是對(duì)圖A～F的矩形區(qū)域的放大。A～F: 標(biāo)尺=100μm, A’～F’: 標(biāo)尺=50μm.圖3 不同時(shí)程應(yīng)激大鼠下丘腦GRP78染色(A)和MMTC分析對(duì)照組(n=6)。A’～F’： 分別是對(duì)圖A～F的矩形區(qū)域的放大；MMTC分析所得散點(diǎn)圖位于圖A～F左上角；A～F： 標(biāo)尺=100μm, A’～F’: 標(biāo)尺=50μm.圖4 不同時(shí)程應(yīng)激大鼠下丘腦ATF4染色(A)和MMTC分析對(duì)照組(n=6)。A’～F’: 分別是對(duì)圖A～F的矩形區(qū)域的放大;MMTC分析所得散點(diǎn)圖位于圖A～F左上角;A～F: 標(biāo)尺=100μm,A’～F’: 標(biāo)尺=50μm.圖5 不同時(shí)程應(yīng)激大鼠下丘腦CHOP染色(A)和(B)MMTC分析對(duì)照組(n=6)。A’～F’: 分別是對(duì)圖A～F 的矩形區(qū)域的放大;MMTC分析所得散點(diǎn)圖位于圖A～F左上角;A～F標(biāo)尺=100μm,A’～F’: 標(biāo)尺=50μm.

3 討論

應(yīng)激是機(jī)體不可避免的生活經(jīng)歷,它可引起內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂并對(duì)機(jī)體各臟器和系統(tǒng)造成影響,其中就包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)[10]。急性應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體有著積極影響,而反復(fù)的長(zhǎng)時(shí)程應(yīng)激刺激常常是有害的,可對(duì)全身各器官造成不同程度的損傷,可對(duì)機(jī)體的功能、代謝造成不良影響[11]。近年來(lái)應(yīng)激對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響,是研究者們關(guān)注的問(wèn)題。HPA軸是應(yīng)激反應(yīng)的中樞,以往研究表明慢性應(yīng)激是引起焦慮、恐懼、重度抑郁以及神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)重要原因[12]。本研究采用了大鼠束縛應(yīng)激加冰水游泳模型,最長(zhǎng)時(shí)程達(dá)21d,旨在模擬機(jī)體在慢性心理性挫折和生理性壓力下,機(jī)體自身調(diào)節(jié)能力的變化以及對(duì)機(jī)體造成的影響。

3.1 血清糖皮質(zhì)激素濃度變化

各種內(nèi)外因素的刺激均可引起HPA軸的興奮,最終導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)釋放大量的糖皮質(zhì)激素來(lái)應(yīng)對(duì)外界刺激,因此機(jī)體中糖皮質(zhì)激素水平的變化能夠很好的反應(yīng)機(jī)體抵抗外界應(yīng)激原的能力。本研究結(jié)果顯現(xiàn)隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),血清中糖皮質(zhì)激素水平呈現(xiàn)出明顯的增高趨勢(shì),表明機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)HPA軸增加了對(duì)外界刺激的防御能力,從而使機(jī)體維持在正常水平。但是隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),21d時(shí)大鼠血清中糖皮質(zhì)激素含量顯著性的降低,表明長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)激已經(jīng)超過(guò)了機(jī)體自身的調(diào)節(jié)能力,使機(jī)體抗損傷的能力顯著性降低,這可能引發(fā)組織細(xì)胞的病理性改變。

3.2 下丘腦神經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)改變

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)能夠特異標(biāo)記尼氏體的硫堇染色觀察到隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),14d組及21d組下丘腦部分神經(jīng)細(xì)胞尼氏體消失、細(xì)胞固縮濃染。結(jié)果提示隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),下丘腦神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了改變,出現(xiàn)了明顯的損傷,可能會(huì)使HPA軸的調(diào)節(jié)功能降低,機(jī)體抗應(yīng)激的能力減弱。

3.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

目前的研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與多種神經(jīng)退行性疾病的病變過(guò)程[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞發(fā)揮自我保護(hù)的一種機(jī)制,但過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可造成機(jī)體的損傷。GRP78僅表達(dá)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)活化的標(biāo)志性因子,它不僅決定著未折疊蛋白反應(yīng)的啟動(dòng)與否,而且在促進(jìn)未折疊蛋白加工成熟以及維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用,因此它對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用[14]。本研究中GRP78的表達(dá)量呈現(xiàn)出一種先增高后降低的趨勢(shì),應(yīng)激21d時(shí)其表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著性降低,提示隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),GRP78對(duì)下丘腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用明顯減弱,使細(xì)胞不能恢復(fù)穩(wěn)態(tài),將激活下游一系列信號(hào)通路,啟動(dòng)并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生損傷及死亡。

CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要因子[15]。正常情況下CHOP的表達(dá)量很低。但當(dāng)過(guò)強(qiáng)或者持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí),CHOP的表達(dá)量顯著性增加,其持續(xù)的高表達(dá)可以阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[16]。PERK信號(hào)通路是導(dǎo)致CHOP表達(dá)增高的最主要的途徑[17]。過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以激活下游信號(hào)通路中的ATF4,ATF4通過(guò)增加其基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而誘導(dǎo)CHOP的持續(xù)表達(dá)[19]。本研究結(jié)果表明應(yīng)激可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)PERK-ATF4-CHOP通路被激活,ATF4和CHOP呈現(xiàn)出持續(xù)性的高表達(dá)。正是由于CHOP蛋白的持續(xù)性表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生損傷及死亡,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的14d開始神經(jīng)細(xì)胞的病理性改變相一致。因此，提示較長(zhǎng)時(shí)程的應(yīng)激導(dǎo)致的下丘腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-ATF4-CHOP通路的激活及高表達(dá)存在因果關(guān)系。