RNA干擾抑制肌腱細(xì)胞V型膠原表達(dá)對膠原纖維形成的影響

張國榮 李鐵軍

(1 長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室, 長春 130117; 2 松原市長嶺縣衛(wèi)生監(jiān)督所, 松原 131500)

肌腱韌帶損傷愈后常常由瘢痕組織替代,膠原纖維內(nèi)的膠原原纖維直徑明顯變小,力學(xué)性能低下,易發(fā)生重復(fù)斷裂[1-2]。肌腱內(nèi)的膠原纖維主要由Ⅰ型膠原蛋白構(gòu)成。Ⅴ型膠原蛋白含量很少,但在損傷肌腱中卻持續(xù)高表達(dá)52周[3]。有研究顯示,過多的Ⅴ型膠原抑制Ⅰ型膠原的生長自聚[4],所以降低Ⅴ型膠原表達(dá)可能有利于促進(jìn)大直徑膠原原纖維的再生,提高損傷肌腱的修復(fù)效果。本課題組前期培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞中膠原原纖維直徑減小,大小相對均一,與損傷肌腱類似[7]。RNA干擾技術(shù)(RNA interference, RNAi)是一種高效、特異阻斷靶mRNA表達(dá)而產(chǎn)生相應(yīng)功能型缺失的新技術(shù)[5-6]。肌腱組織中Ⅴ型膠原的分子組成為COL5(α1)2(α2),本研究利用RNAi法干擾大鼠肌腱細(xì)胞中COL5α1和COL5α2基因表達(dá),構(gòu)建成組織工程肌腱進(jìn)行膠原含量測定與微觀形態(tài)檢測,體外研究降低V型膠原表達(dá)對膠原纖維生長自聚的影響,從而探求V型膠原在肌腱損傷修復(fù)過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 肌腱細(xì)胞培養(yǎng)及組織工程肌腱的構(gòu)建

取SD大鼠跟腱,按常規(guī)方法培養(yǎng)肌腱細(xì)胞,取P5以內(nèi)的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。培養(yǎng)大鼠肌腱細(xì)胞,定期更換培養(yǎng)基并加入維生素C以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌和防止細(xì)胞老化。2周后,沿培養(yǎng)皿邊緣慢慢卷起細(xì)胞片,繼續(xù)培養(yǎng)1周,使細(xì)胞片光滑面與粗糙面充分融合形成圓柱形的組織工程肌腱[7]。

1.2 損傷肌腱模型的制備

損傷肌腱組織來源于SD大鼠髕韌帶,做1mm×4mm 全層窗口缺損,自然修復(fù)1周。對照組為SD大鼠正常髕韌帶組織。

1.3 實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)

取大鼠損傷自然修復(fù)后的肌腱組織和體外構(gòu)建的組織工程肌腱,以正常肌腱組織作為對照組。采用-actin為內(nèi)參,實時熒光定量PCR(real time PCR, RT-PCR)，RT-PCR法檢測COL5α1、COL5α2和COL1α1基因的表達(dá)。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染大鼠肌腱細(xì)胞及分組

由Ambion公司合成干擾COL5α1和COL5α2亞基的siRNA序列[8],用Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的大鼠肌腱細(xì)胞。轉(zhuǎn)染干擾COL5α1亞基的siRNA為α1siRNA實驗組,轉(zhuǎn)染干擾COL5α2亞基的siRNA為α2siRNA實驗組,轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的亂序siRNA為對照組。

1.5 RT-PCR法及免疫熒光法檢測肌腱細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)

肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染特定siRNA 48h后,收集肌腱細(xì)胞,提取RNA,采用actin為內(nèi)參,RT-PCR法定量分析COL5α1、COL5α2和COL1α1基因的表達(dá)。肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染特定siRNA 72h后,免疫熒光法檢測COL5α1和COL5α2在蛋白水平的表達(dá)。

1.6 肌腱細(xì)胞膠原含量測定

將α1siRNA實驗組、α2siRNA實驗組和對照組培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞制成組織工程肌腱,用膠原含量測定試劑盒檢測膠原含量。

1.7 透射電鏡檢測肌腱細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

將α1siRNA實驗組、α2siRNA實驗組和對照組培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞制成組織工程肌腱,制作透射電鏡標(biāo)本,檢測內(nèi)部的膠原原纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 損傷肌腱與組織工程肌腱中相關(guān)基因的表達(dá)

損傷肌腱中COL5α1與COL5α2表達(dá)均明顯升高。同時,組織工程肌腱中COL5α1與COL5α2表達(dá)也明顯升高,尤其COL5α2表達(dá)升高顯著(圖1)。在損傷肌腱和組織工程肌腱中COL1α1表達(dá)沒有明顯變化。

圖1 損傷肌腱、組織工程肌腱與正常肌腱中COL5α1、COL5α2與COL1α1基因的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA后肌腱細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)

α1siRNA實驗組中COL5α1基因表達(dá)被明顯抑制,抑制程度約70%,COL5α2與COL1α1表達(dá)沒有明顯改變。α2siRNA實驗組中COL5α2基因表達(dá)被明顯抑制,抑制程度約80%,COL5α1表達(dá)被抑制約30%,COL1α1表達(dá)被抑制約80%(圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染48h后,COL5α1、COL5α2和COL1α1在基因水平的表達(dá)

轉(zhuǎn)染72h后,免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，α1siRNA實驗組中COL5α1蛋白表達(dá)被明顯抑制(圖3A～3C),α2siRNA實驗組中COL5α2蛋白表達(dá)被明顯抑制(圖3D～3F)。

2.3 組織工程肌腱的膠原含量

膠原含量測定結(jié)果顯示,α1siRNA實驗組與α2siRNA實驗組中,組織工程肌腱的膠原含量與對照組相比減少約60%(圖4)。

圖4 組織工程肌腱的膠原含量分析

圖6 轉(zhuǎn)染48h后,COL5α1、COL5α2與COL1α1基因表達(dá)的比例分析

圖3 轉(zhuǎn)染72h后,COL5α1 (A～C)和COL5α2 (D～F)蛋白的表達(dá)

圖5 透射電鏡檢測組織工程肌腱,×73000 (A);膠原原纖維直徑直方圖,n≥300 (B)

2.4 組織工程肌腱的膠原纖維微觀結(jié)構(gòu)

透射電鏡結(jié)果顯示α1siRNA實驗組膠原原纖維數(shù)量減少,直徑變小,輪廓模糊,膠原原纖維形成障礙(圖5)。α2siRNA實驗組膠原原纖維數(shù)量減少,直徑變小,但與α1 siRNA實驗組相比,膠原原纖維數(shù)量多,直徑略大,輪廓未模糊(圖5),表明COL5α1與COL5α2分別被抑制后,組織工程肌腱中膠原原纖維結(jié)構(gòu)變化不同。

2.5 相關(guān)基因表達(dá)比例分析

α1siRNA實驗組中,COL5α1被抑制約70%,COL5α2與COL1α1沒有明顯變化,所以COL5α2/COL1α1不變,COL5α1/COL1α1降低。α2siRNA實驗組中,COL5α2被抑制約80%,COL5α1下降約30%,COL1α1下降約80%,所以COL5α2/COL1α1不變,COL5α1/COL1α1反而升高。

3 討論

本實驗培養(yǎng)大鼠肌腱細(xì)胞,構(gòu)建無支架的組織工程肌腱。此組織工程肌腱由小直徑膠原原纖維構(gòu)成[7],Ⅴ型膠原表達(dá)顯著升高,與損傷肌腱類似。利用RNAi法抑制Ⅴ型膠原2個亞基COL5α1和COL5α2的表達(dá)。結(jié)果表明,siRNA分子通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠肌腱細(xì)胞后,有效抑制了COL5α1和COL5α2在基因和蛋白水平的表達(dá),為體外研究下調(diào)肌腱細(xì)胞Ⅴ型膠原表達(dá)提供了可行的實驗方法。

本研究通過siRNA抑制肌腱細(xì)胞中Ⅴ型膠原2個亞基表達(dá),α1siRNA實驗組和α2siRNA實驗組膠原含量均下降約60%,表明抑制Ⅴ型膠原后,膠原纖維合成減少。膠原纖維主要由I型膠原蛋白構(gòu)成,基因檢測結(jié)果顯示,α1siRNA實驗組中COL1α1表達(dá)沒有明顯改變,α2siRNA實驗組中COL1α1表達(dá)下降約80%。α1siRNA實驗組和α2siRNA實驗組中COL1α1基因表達(dá)差異巨大,組織工程肌腱中膠原合成量卻相近,表明膠原纖維合成量不是由COL1α1基因表達(dá)水平一個因素決定,還受其他因素影響。

肌腱損傷后的自然修復(fù)過程中Ⅴ型膠原表達(dá)升高[9-11],Ⅴ型膠原可能是肌腱損傷修復(fù)的必需因子,但過高表達(dá)會使修復(fù)組織中膠原原纖維直徑明顯變小。α1siRNA實驗組中COL5α1/COL1α1下降,可能無法達(dá)到Ⅴ型膠原與Ⅰ型膠原比值的最低要求,導(dǎo)致膠原原纖維形成障礙。α2siRNA實驗組中COL5α1/COL1α1升高,這種變化類似于損傷肌腱修復(fù)過程,與對照組相比產(chǎn)生更小直徑的膠原原纖維。上述結(jié)果表明,COL5α1/COL1α1過高或過低都不利于損傷肌腱修復(fù),只有保持在適當(dāng)水平才有可能形成大直徑膠原原纖維。α1siRNA實驗組膠原合成量下降可能是因為COL5α1/COL1α1低于最低要求,膠原原纖維形成障礙導(dǎo)致。α2siRNA實驗組膠原合成量下降可能是因為COL1α1表達(dá)降低,Ⅰ型膠原蛋白合成不足導(dǎo)致。

總之,本研究利用RNAi法抑制肌腱細(xì)胞中Ⅴ型膠原2個亞基表達(dá),檢測相關(guān)基因變化；構(gòu)建組織工程肌腱,檢測膠原含量和微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,COL5α1/COL1α1可能需要保持在適當(dāng)水平才能使損傷肌腱再生大直徑膠原原纖維,為進(jìn)一步研究指明了方向。本研究為促進(jìn)損傷肌腱修復(fù)提供了重要的基礎(chǔ)生物學(xué)信息和潛在的基因治療手段。