透射電鏡在糖尿病大鼠腸上皮細(xì)胞連接分析中的應(yīng)用

常志尚 毋亞仙 劉立娜 譚金山 劉 穎 梁 惠

(青島大學(xué), 1 生物醫(yī)學(xué)公共支撐平臺(tái), 2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2016級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè), 3 國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 4 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 5 公共衛(wèi)生學(xué)院, 青島 266071)

近年來,隨著人口老齡化及人們生活水平的提高,糖尿病的患病率逐年升高[1]。多項(xiàng)研究證實(shí),腸黏膜屏障功能異常與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。細(xì)胞之間連接裝置在維持腸黏膜機(jī)械屏障結(jié)構(gòu)和功能完整性方面發(fā)揮重要作用[3],因此,熟悉和掌握細(xì)胞間連接裝置形態(tài)學(xué)變化及其檢測(cè)方法,對(duì)了解糖尿病腸黏膜屏障損傷狀況具有重要意義。透射電鏡技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的重要研究手段,但透射電鏡技術(shù)對(duì)生物樣品切片制樣及超微結(jié)構(gòu)分析都提出了嚴(yán)格要求,不同的組織材料需采用不同的制樣條件,若處理不當(dāng),可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真甚至實(shí)驗(yàn)失敗[4]。本研究采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,優(yōu)化制樣條件制備回腸組織超薄切片,采用透射電鏡對(duì)腸上皮細(xì)胞連接裝置進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察和分析,旨在為糖尿病影響腸黏膜機(jī)械屏障結(jié)構(gòu)與功能提供客觀依據(jù),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

STZ購自北京Solarbio科技有限公司;檸檬酸、檸檬酸鈉、戊二醛、四氧化鋨、812環(huán)氧樹脂、甲苯胺藍(lán)、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛，均為分析純,購自北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;高脂飼料(豬油10%、蔗糖20%、蛋黃粉15%、膽固醇1.2%、豬膽鹽0.2%、鼠維持飼料53.6%，均為國(guó)產(chǎn));claudin、occludin、ZO-1一抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 STZ溶液配制

稱取檸檬酸2.1g,加入雙蒸水100ml中配成A液;稱取檸檬酸鈉2.94g，加入雙蒸水100ml中配成B液。A液與B液以1∶1混合,調(diào)節(jié)pH至4.2～4.4。稱取1.0g STZ,加入檸檬酸緩沖液至100ml溶解。冰上保存,現(xiàn)用現(xiàn)配,配好的溶液在30min內(nèi)注射完畢。

1.3 模型建立與分組

雄性Wistar大鼠30只,體質(zhì)量(180±20) g,購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司,動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(魯)20130001。隨機(jī)分為2組： 正常對(duì)照組和模型組。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,禁食不禁水12h,尾靜脈取血檢測(cè)空腹血糖,作為該批次動(dòng)物基礎(chǔ)血糖值。正常對(duì)照組繼續(xù)飼喂普通飼料,模型組更換高脂飼料,喂養(yǎng)30d后,模型組大鼠腹腔注射1% STZ溶液,正常對(duì)照組注射檸檬酸緩沖液。繼續(xù)喂養(yǎng)1周后,禁食不禁水12h,再次檢測(cè)尾血血糖,血糖值>11.1mmol/L即為建模成功。成模大鼠繼續(xù)飼喂高脂飼料,正常對(duì)照組大鼠飼喂普通飼料,持續(xù)4周,并于第4周末禁食不禁水12h,再次檢測(cè)尾血血糖。30%烏拉坦麻醉大鼠,剖開腹腔,腹主動(dòng)脈取血處死大鼠,迅速分離回盲部以上4cm回腸組織,部分用于透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察,部分用于免疫印跡檢測(cè)。

1.4 空腹血糖水平檢測(cè)

采集尾血,采用羅氏血糖儀測(cè)定各組動(dòng)物血糖值。

1.5 大鼠腸上皮細(xì)胞連接裝置超微結(jié)構(gòu)觀察

采用透射電鏡技術(shù)對(duì)各組大鼠回腸組織細(xì)胞間連接裝置病理形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。具體步驟如下：

1.5.1 取材 各組隨機(jī)留取5只大鼠回腸組織1cm,37℃溫生理鹽水迅速漂洗3次,濾紙拭干,迅速將腸組織置于蠟盤上并滴加4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液。用鋒利刀片切取1mm×2mm腸壁組織塊2塊,迅速投入預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中,4℃保存。

1.5.2 脫水包埋 取戊二醛固定后腸組織樣品,PBS(pH=7.2)漂洗3次,1%四氧化鋨后固定80min,梯度丙酮脫水,812環(huán)氧樹脂包埋,聚合。

1.5.3 半薄切片制備 修整包埋塊并將其置于超薄切片機(jī)上,用鉆石刀切出1μm厚度半薄切片,1%甲苯胺藍(lán)染色30s,流水沖洗,晾干。

1.5.4 腸組織定位 取半薄切片置顯微鏡下觀察,選擇腸腔內(nèi)側(cè)面、染色清晰、切面完整的區(qū)域作為超薄切片目標(biāo)區(qū)域,根據(jù)半薄切片圖像提示從樣品塊上選取目標(biāo)區(qū)域,以目標(biāo)區(qū)域?yàn)橹行膶悠窋嗝嫘蕹?.2mm×0.2mm的正方形。

1.5.5 超薄切片制備及染色觀察 將定位后的樣品塊置于超薄切片機(jī)上,使用鉆石刀切取超薄切片,切片厚度70nm,刀速1mm/s連續(xù)濕式切片,150目方華膜銅網(wǎng)撈片。醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛染色。使用透射電鏡對(duì)各組大鼠腸上皮細(xì)胞連接裝置進(jìn)行觀察拍攝。

1.6 大鼠腸黏膜細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用免疫印跡檢測(cè)各組大鼠回腸組織claudin、occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平,以β-actin作為內(nèi)參照,結(jié)果經(jīng)掃描后輸入計(jì)算機(jī),并進(jìn)行圖像分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血糖水平檢測(cè)

注射STZ 1周后,篩選模型組血糖值>11.1mmol/L的大鼠組成新的模型組,其血糖值較正常對(duì)照組顯著增高(P<0.05)。持續(xù)喂養(yǎng)4周后,模型組血糖值依然保持在較高水平,與正常對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且血糖值無明顯回落現(xiàn)象(表1)。

表1 各組大鼠血糖水平檢測(cè)

*P<0.05vsnormal control group

2.2 腸上皮細(xì)胞連接裝置超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化

正常對(duì)照組5只(5/5)大鼠回腸組織腸上皮細(xì)胞連接裝置形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常,無縫隙增寬等異常病理學(xué)表現(xiàn)。模型組5只(5/5)大鼠緊密連接與正常對(duì)照組比較稍感松弛,電子密度均有所降低;同時(shí),中間連接、縫隙連接等連接裝置出現(xiàn)縫隙明顯增寬現(xiàn)象(圖1)。

2.3 腸黏膜細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化

模型組大鼠回腸組織claudin、occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平均較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05),提示糖尿病大鼠腸黏膜細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)受到抑制(圖2)。

圖1 各組大鼠腸上皮細(xì)胞連接裝置超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)觀察

3 討論

透射電鏡是以電子束作為“光源”,通過電磁透鏡成像的電子光學(xué)儀器,放大倍數(shù)可達(dá)幾十萬倍[4]。透射電鏡技術(shù)在各種組織超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)觀察過程中發(fā)揮無可替代的關(guān)鍵作用,同時(shí),其組織切片的制作質(zhì)量對(duì)觀察效果也有較大影響[5]。首先,超薄切片技術(shù)是透射電鏡技術(shù)中最重要、最基本、最常用的技術(shù),由于電子穿透力低,觀察樣品必須制備成超薄切片,通常為70nm左右,其步驟較石蠟切片更復(fù)雜、要求更嚴(yán)格[6]。其次,透射電鏡切片要求取材部位準(zhǔn)確、一致。本研究為避免取材部位不同造成結(jié)果差異,統(tǒng)一將取材部位定為回盲部以上4cm回腸組織,從而保證觀察結(jié)果更具可比性。第三,由于腸道表面有皺襞、絨毛等結(jié)構(gòu),必須仔細(xì)清洗腸腔表面殘留的腸內(nèi)容物,否則會(huì)影響切片質(zhì)量,損壞鉆石刀。本研究在取材過程中,對(duì)回腸組織采用37℃溫生理鹽水清洗30s,以模擬組織在體環(huán)境,解決了常規(guī)4℃預(yù)冷生理鹽水清洗樣品發(fā)生腸道組織遇冷收縮不易清洗干凈的情況。第四,四氧化鋨后固定時(shí)間的選擇也是制樣過程中的重要一步。固定時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)造成樣品太脆不易切片、固定時(shí)間不足會(huì)造成切片襯度過低[7]。本研究不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,顯示回腸組織使用1%鋨酸后固定80min效果最好。第五,由于超薄切片面積小,需要對(duì)樣品進(jìn)行半薄切片精確定位。本研究主要觀察腸上皮細(xì)胞連接裝置,在定位過程中選取腸腔內(nèi)側(cè)、染色清晰、切片完整的區(qū)域作為目標(biāo)區(qū);同時(shí),修塊時(shí)腸腔內(nèi)側(cè)游離面外保留了一部分包埋劑,且內(nèi)側(cè)邊緣與切片方向平行或成銳角,避免出現(xiàn)切片厚度不均或斷裂的現(xiàn)象。此外,本研究采用甲苯胺藍(lán)對(duì)半薄切片染色后定位,與范曉燕等[8]介紹的不染色直接在相差顯微鏡下觀察不同,染色后組織結(jié)構(gòu)更清晰易辯,并且使用普通生物顯微鏡即可觀察,方便了對(duì)樣品待觀察部位的精確定位。

圖2 大鼠回腸組織細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平

本研究成功制備糖尿病大鼠回腸組織透射電鏡切片,并對(duì)腸上皮細(xì)胞連接裝置進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察,以便直接客觀了解糖尿病大鼠腸黏膜機(jī)械屏障功能狀況。細(xì)胞連接是細(xì)胞之間相互聯(lián)系、發(fā)揮協(xié)同作用的重要超微結(jié)構(gòu),主要包括緊密連接、中間連接、橋粒、縫隙連接等,其中,緊密連接是腸黏膜上皮細(xì)胞間最主要的連接方式,在封閉細(xì)胞間隙,維持腸道屏障結(jié)構(gòu)與功能完整性方面發(fā)揮決定性作用;中間連接、橋粒及縫隙連接具有黏合細(xì)胞、增強(qiáng)組織機(jī)械性、協(xié)調(diào)細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)等作用[9]。細(xì)胞連接裝置異常增寬,可使腸壁完整性遭到破壞,腸黏膜屏障功能受損,致使腸道內(nèi)某些有毒物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán),對(duì)機(jī)體組織器官造成損害,導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。

本研究采用透射電鏡技術(shù)對(duì)腸黏膜細(xì)胞連接裝置超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,獲得了良好的效果。結(jié)果證實(shí),糖尿病大鼠腸上皮細(xì)胞連接裝置發(fā)生縫隙增寬、電子密度降低等異常病理變化,與相關(guān)報(bào)道一致[10]。為驗(yàn)證透射電鏡觀察結(jié)果,本研究采用免疫印跡對(duì)回腸組織中部分緊密連接相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。其中,claudin、occludin為跨膜蛋白,是構(gòu)成緊密連接的主要骨架蛋白,ZO-1為膜周蛋白,它們對(duì)維持腸黏膜上皮細(xì)胞極性和調(diào)節(jié)腸黏膜屏障通透性具有重要作用[11]。結(jié)果顯示,糖尿病大鼠回腸組織claudin、occludin及ZO-1蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯下調(diào),與透射電鏡觀察結(jié)果一致，表明通過透射電鏡觀察細(xì)胞連接病理學(xué)變化具有較高的可靠性。