紅景天苷對中波紫外線誘導(dǎo)HaCaT細胞凋亡的影響?

饒 燕 韓曉鳳 陶春蓉

(重慶市第一人民醫(yī)院/重慶市中醫(yī)院皮膚科, 重慶 400011)

中波紫外線(ultraviolet radiation b, UVB)波長275～320nm,可誘導(dǎo)皮膚產(chǎn)生紅斑,引起DNA損傷、皮膚細胞凋亡和皮膚腫瘤[1-2]。紅景天苷有抗衰老、抗氧化、增強機體免疫力、抗病毒和改善心腦血管系統(tǒng)等功能,但其在抗UVB輻射中的作用尚不清楚[3]。研究顯示,電離輻射、機械損傷、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、氧化還原損傷、低糖血癥等生理或病理因素可引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)并激活未折疊蛋白反應(yīng)和caspase 12和前細胞調(diào)亡因子(C/EBP-homologous protein, CHOP)介導(dǎo)的細胞凋亡[4]。因此,本研究以人角質(zhì)形成細胞HaCaT為研究對象,探討紅景天苷對UVB輻射引起的細胞凋亡的影響和可能的參與機制。

1 材料和方法

1.1 細胞及主要試劑

人永生化角質(zhì)形成細胞株HaCaT由本實驗室保存,紅景天苷(每支20mg,批號： H-040-141103)購買于成都瑞芬思生物科技有限公司;1640培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(永捷實驗室);UVB紫外線光療儀(Sigma);酶標儀(普朗);Western細胞裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、β-actin抗體(碧云天生物技術(shù)研究所);SYBR?Premix Ex TaqTM、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(TaKaRa公司);caspase 3、caspase 12一抗(Abcam公司);CHOP一抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠、山羊抗兔二抗(Santa Cruz公司);引物合成(英駿生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和藥物配制

用1640培養(yǎng)基(10%FBS,1%的青鏈霉素)37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Hacat細胞,每2d換1次液,待細胞融合度達到85%進行傳代,傳代2次后,選擇生長旺盛、狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

取紅景天苷20mg,以無血清的1640培養(yǎng)基將其配制成2mg/ml的母液,0.22μm濾器過濾除菌,再以無血清的1640培養(yǎng)基配制成終濃度分別為50、100、200、400、800μg/ml的藥液,-20℃分裝避光保存。

1.3 MTT檢測紅景天苷的安全藥物濃度

將生長良好的HaCaT細胞用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化成單細胞懸液,以1×104/ml接種到96孔板中,每孔100μl,待細胞貼壁后,去除原培養(yǎng)液,分成7個組,每組6個復(fù)孔。各組分別加入上述不同濃度的紅景天苷培養(yǎng)液200μl,并設(shè)置空白組和對照組。37℃,5%CO2培養(yǎng)24h后,每孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl,37℃,5%CO2孵育4h,去除培養(yǎng)基,每孔加入100μl DMSO,搖床上振蕩10min,待甲瓚結(jié)晶完全溶解,使用酶標儀570nm處測OD值。

1.4 細胞分組及處理方法

將生長良好的Hacat細胞以1×106/ml接種于6孔板,待細胞融合度達到80%,分為正常對照組(NC組),不加任何試劑,不進行UVB照射;紅景天苷處理組,加入終濃度為200μg/ml的紅景天苷,不進行UVB照射; UVB組,僅用30mJ/cm2的UVB處理[5]; UVB+紅景天苷,30mJ/cm2的UVB照射后,加入終濃度為200μg/ml的紅景天苷。每組3個復(fù)孔,各組細胞于37℃,5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.5 MTT檢測細胞增殖

將生長良好的HaCaT細胞以1×104/ml接種到96孔板中,每孔100μl,待細胞貼壁后,按上述實驗方法分成4組進行培養(yǎng),每組6個復(fù)孔,并設(shè)置空白對照組。具體檢測方法參照1.3。

1.6 流式檢測細胞凋亡

將HaCaT細胞接種于6孔板,分成4個實驗組,每組3個復(fù)孔,24h后,將細胞消化下來,懸浮于預(yù)冷的PBS中,送到第三軍醫(yī)大學(xué)流式細胞儀檢測凋亡。

1.7 Real-time PCR檢測凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平

以上4組細胞,提取總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后以cDNA為模版,Real-time PCR實時檢測熒光強度。Real-time PCR的反應(yīng)體系為： SYBR?Premix Ex TaqII (2×) 6.25μl,上下游引物(10μmol/L)各0.5μl, cDNA 1μl, dH2O (sterile distilled water) 4.25μl,總體積為12.5μl。反應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性30s;95℃ 5s,60℃ 30s,40個循環(huán);熔解曲線95℃ 5s,60℃ 1min,95℃ 1s;冷卻50℃ 30s。

根據(jù)Genbank中人相關(guān)基因序列,選擇保守區(qū),使用Premier 5.0軟件設(shè)計引物,經(jīng)BLAST分析證實引物特異性后交由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。熒光定量PCR引物信息見表1。

表1 凋亡相關(guān)基因引物設(shè)計

1.8 免疫印跡檢測凋亡相關(guān)基因的蛋白水平

上述4組細胞處理24h后,收集總蛋白,進行10% SDS-PAGE分離電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到NC膜(100V,60min),5%脫脂奶粉封閉1h,一抗caspase 3(1∶1000)、caspase 12(1∶1000)、CHOP(1∶500)、β-actin(1∶500)4℃孵育過夜,次日TBST洗8min×4次,辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(1∶5000)室溫孵育1h。TBST洗8min×4次,C-Digital western曝光儀上曝光6min。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測紅景天苷對UVB介導(dǎo)的細胞增殖的影響

紅景天苷濃度為0、50、100、200、400、800μg/ml時,吸光度分別為0.849±0.023、0.837±0.014、0.831±0.021、0.849±0.021、0.697±0.037、0.566±0.022,紅景天苷濃度在50、100、200μg/ml時,與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);紅景天苷濃度為400、800μg/ml時,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明紅景天苷濃度在50、100、200μg/ml為作用于Hacat細胞的有效安全濃度。本實驗選用的濃度為200μg/ml。

MTT檢測Hacat細胞增殖,OD值與活細胞數(shù)成正比。結(jié)果顯示,NC組、紅景天苷處理組、UVB組和UVB+紅景天苷組的OD值分別為0.816±0.012、0.798±0.024、0.331±0.010和0.754±0.014,與NC組相比,UVB組的OD值明顯降低(P<0.05),加紅景天苷處理后,OD值顯著上升且與NC組相當(dāng)(圖1)。

2.2 流式細胞儀檢測

細胞凋亡結(jié)果顯示,與NC組相比較,UVB組的凋亡率增加26.03%,紅景天苷處理后,凋亡率較UVB組減少23.22%(圖2)。

2.3 Real-time PCR檢測凋亡相關(guān)基因的mRNA水平

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,NC組和紅景天苷處理組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與NC組相比,UVB組凋亡相關(guān)基因的mRNA水平明顯增加(P<0.05),UVB+紅景天苷組較UVB組明顯減少(P<0.05)(表2)。

圖1 紅景天苷對UVB誘導(dǎo)的細胞增殖的影響

圖2 紅景天苷對UVB誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響

GroupCaspase 3Caspase 12CHOPNC 0.031±0.0070.010±0.0020.006±0.000Salidroside 0.032±0.0060.012±0.0020.005±0.000UVB0.105±0.005*0.020±0.002*0.015±0.001*UVB+salidroside 0.051±0.005#0.012±0.004#0.008±0.001#

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsUVB group

2.4 免疫印跡檢測凋亡相關(guān)基因的蛋白表達

結(jié)果顯示,UVB組凋亡相關(guān)基因的蛋白水平較NC組明顯升高(P<0.05),而加紅景天苷處理后,凋亡相關(guān)基因的蛋白水平明顯降低(P<0.05)(圖3,表3)。

圖3 凋亡相關(guān)蛋白電泳條帶

GroupCaspase 3Caspase 12CHOPNC0.109±0.0110.078±0.0110.042±0.008Salidroside 0.122±0.0090.068±0.0130.052±0.009UVB0.802±0.014*0.227±0.015*0.131±0.007*UVB+salidroside 0.142±0.008#0.076±0.011#0.073±0.006#

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsUVB group

3 討論

近年來隨著環(huán)境污染日益加重,紫外輻射成為影響人類健康的重要環(huán)境因素之一。紫外輻射可誘發(fā)光老化,引起皮膚衰老,特別是UVA和UVB輻射,可造成皮膚紅斑,加速老化。覆蓋于皮膚表面的角質(zhì)形成細胞,是UVB能量作用的主要部位,紫外輻射引起的皮膚老化過程中,角質(zhì)形成細胞的凋亡發(fā)揮著重要作用[6-7]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂時產(chǎn)生的一系列應(yīng)答反應(yīng),引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂的因素主要有電離輻射、氧化還原損傷、機械損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等[8]。其中,參與調(diào)解的主要有3種跨膜分子,分別是肌醇依賴性激酶、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和活化轉(zhuǎn)錄因子6[9-10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對細胞具有雙重作用,當(dāng)損傷不嚴重時,這3種分子啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的生存途徑,激活未折疊蛋白反應(yīng),清除錯誤折疊的蛋白,使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)正常;當(dāng)外界刺激持續(xù)或過強時,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能持續(xù)紊亂,穩(wěn)態(tài)無法重建,這3個信號通路將激活下游的DNA損傷基因153(GADD153/CHOP)和caspase 12,最終誘導(dǎo)細胞凋亡[11-12]。

已知紫外輻射主要產(chǎn)生氧化還原損傷[13]。本實驗結(jié)果顯示,與對照組相比較,UVB組細胞凋亡相關(guān)基因caspase 3、caspase 12和CHOP的mRNA和蛋白水平顯著升高。說明UVB輻射角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生的凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。研究表明,中藥紅景天具有增強記憶力、抗衰老、增強免疫、改善心腦血管系統(tǒng)、抗病毒等作用,還能減輕紫外輻射引起的光老化和炎癥反應(yīng),其中有效成分是紅景天苷[14-15]。本研究結(jié)果可見,加紅景天苷處理后,細胞凋亡減少了23.22%,而細胞增殖明顯提高,caspase 3、caspase 12和CHOP的轉(zhuǎn)錄和表達水平明顯減少,接近正常對照組。說明紅景天苷可以通過抑制caspase 12和CHOP的表達有效降低UVB引起的HaCaT細胞凋亡。