納米銀涂層可吸收線吻合小鼠腸壁近期抗炎療效的實驗研究?

劉雪來 宋巖彪 張 創(chuàng) 曹學(xué)會 靳曉次 費 川 張永婷 李索林

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院小兒外科，石家莊 050000)

納米顆粒是一類小于100 nm，為生物細胞直徑1/100～1/1000的新材料[1,2]，與生物大分子(如多肽、蛋白質(zhì)、核酸)和藥物分子大小相仿。與傳統(tǒng)微米級藥物顆粒相比，其具有良好的靜電吸附效應(yīng)，可聚集在膜表面、改善膜電位、吸附和聚集外源性配體或糖蛋白、調(diào)控胞膜和胞漿內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，表現(xiàn)出藥物分子或傳統(tǒng)微米級大顆粒材料無法發(fā)揮的生物醫(yī)學(xué)優(yōu)勢[3,4]。其中，納米銀顆粒作為一種新型納米金屬顆粒材料，已被證實能有效阻斷細菌呼吸鏈而具有抗菌作用[5]。此外，近來納米銀顆粒介導(dǎo)的抗炎作用也受到關(guān)注，是目前創(chuàng)傷外科領(lǐng)域的研究熱點內(nèi)容之一。Tian等[6]將涂有納米銀顆粒的敷料覆蓋于炎癥性創(chuàng)口表面，觀察到可有效抑制炎癥細胞浸潤和降低創(chuàng)口炎癥蛋白表達而促進傷口功能細胞的增殖和移行，降低創(chuàng)傷后局部組織發(fā)生感染的機會，加快創(chuàng)傷后傷口組織的修復(fù)；Wong等[7]觀察到納米銀顆粒介導(dǎo)的抗炎作用能有效降低腹膜炎癥反應(yīng)，有效降低腸粘連和腸梗阻的發(fā)生。在此基礎(chǔ)上，我們的前期研究[8]將納米銀顆粒與具有抗炎作用的納米載體進行螯合，將螯合物局部應(yīng)用于燙傷傷口創(chuàng)面，證實納米銀顆粒具有良好的抗炎特性，以及納米載體進行螯合之后在抗炎療效方面表現(xiàn)出生物協(xié)同作用。

鑒于此，本研究采用組織工程學(xué)技術(shù)在普通可吸收縫合線表面制作納米銀顆粒涂層，制備具有抗炎特性的納米銀涂層可吸收縫線，并將該縫線用于小鼠腸切除腸吻合模型，旨在探索其抗炎特性和效果。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

帶針薇喬可吸收線(4-0，Vicryl suture，Polyglactin 910，全長45 cm)和相同粗細的三氯生抗菌涂層薇喬可吸收線(4-0，Vicryl plus，縫針13 mm 1/2弧度，全長45 cm)購自強生公司(美國)。磷酸鹽緩沖液(PBS)和枸櫞酸鹽溶液(Solarbio，中國)，白介素6(IL-6)抗體(Abcam，英國)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體(Abcam，英國)，增殖性細胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen，PCNA)抗體(Abcam，英國)，山羊抗兔IgG(Bioworld，美國)，DAB檢測試劑盒(中杉金橋，中國)用于免疫組織化學(xué)形態(tài)研究。1%戊巴比妥鈉、二烯丙基二甲基氯化銨(分子量20.00～35.00)、聚甲基丙烯酸鈉(分子量9500)、硝酸銀溶液、氯化鈉溶液、乙酸鈉溶液購自Sigma(美國)。采用1 mmol/L乙酸鈉溶液調(diào)定上述溶液酸堿度至pH=7。無菌水稀釋硝酸銀至1 mmol/L。

1.2 納米銀顆粒和納米銀涂層可吸收線的制備

納米銀顆粒的制備參照我課題組前期報道[9,10]。固定液配備：等量1 mmol/L聚甲基丙烯酸鈉和硝酸銀溶液混合后紫外線照射4 h。黏附液的配備：無菌水稀釋二烯丙基二甲基氯化銨至濃度為1 mmol/L。納米銀涂層可吸收線制備方法參照文獻[11]，經(jīng)典化學(xué)逐層涂層法。采用無菌帶針普通薇喬可吸收線纏繞于塑料磨具后依次放置于固定液和黏附液內(nèi)，各1 min，置于雙蒸水內(nèi)1 min，甩干后重新放置于2種溶液內(nèi)和雙蒸水內(nèi)，如此反復(fù)。制備的納米銀涂層可吸收線放置于室溫下，過夜，干燥。

分別將帶針普通薇喬可吸收線(普通可吸收線組)、三氯生涂層薇喬可吸收線(抗菌可吸收線組)和納米銀涂層可吸收線(納米銀涂層可吸收線組)各自剪斷1 cm用于掃描電鏡觀察，剩余縫合線各自用于動物實驗。本研究采用涂層10次的納米銀可吸收線進行吻合。

1.3 動物分組和實驗操作

所有實驗程序均遵守動物福利道德原則。12只10～12周Balb/C小鼠購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，雌雄各半，體重20～24 g，平均22 g(合格證編號：1708105)。隨機分為3組，每組4只。采用1%戊巴比妥鈉腹膜腔注射麻醉，仰臥位平放操作板上，采用組織切片刀剃除腹壁表面的毛發(fā)，局部常規(guī)碘伏消毒。在每只小鼠右下腹壁縱向切口，濕紗布保護術(shù)野，無菌平鑷提起全腹壁，在距離小鼠回盲部2 cm處用組織剪橫向剪斷回腸，以無菌水注射器沖洗腸壁斷端，3組分別用4-0帶針薇喬可吸收線、三氯生抗菌涂層薇喬可吸收線或納米銀涂層可吸收線單層間斷行端端吻合，皮膚切口采用粘皮膠封合。術(shù)后1周處死實驗小鼠，取材部位為以吻合口為中心的腸壁組織(縱向10 mm，橫向5 mm)。

1.4 觀察指標

電鏡下觀察可吸收線表面是否有納米銀涂層。免疫組化法檢測3種可吸收線(普通可吸收線、抗菌素可吸收線、納米銀涂層可吸收線)用于動物腸切除腸吻合之后，吻合口局部炎癥蛋白(即IL-6和TNF-α)表達和修復(fù)過程中增殖細胞(即PCNA)數(shù)量差異。

1.4.1 免疫組化方法觀察吻合口局部IL-6、TNF-α和PCNA 新鮮小鼠腸壁取材后OCT包埋，液氮異戊烷低溫冷凍組織，連續(xù)切片(切片厚度5 μm)，95%乙醇固定切片，-20 ℃低溫保存待用。取出切片，室溫放置5 min待切片回復(fù)室溫并干燥。常規(guī)免疫組化染色操作。顯微鏡下觀察。

1.4.2 半定量分析吻合口局部IL-6、TNF-α和PCNA的表達 采用雙盲法進行免疫組化定量表達分析。普通光學(xué)顯微鏡下放大400倍，棕黃色顆粒為陽性蛋白表達，IL-6和TNF-α各組分別隨機取5個視野(吻合口區(qū)域)，應(yīng)用圖像分析軟件Image pro plus 6.0測量積分光密度(IOD)和面積(Area)并計算出平均光密度(OD)，OD=IOD/Area。PCNA各組隨機取吻合口區(qū)域5個400倍視野采用人工法數(shù)陽性細胞進行半定量檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡下可見吸收線表面涂有納米銀顆粒

采用疊加涂層將納米銀涂層于縫線表面，掃描電鏡下可見銀顆粒涂于縫線表面(圖1)。

圖1 3組可吸收線掃描電鏡圖(×350)?？梢娂{米銀可吸收線表面銀白色的納米銀顆粒涂層(連續(xù)涂層5次)。注：因溶液浸泡因素，納米銀涂層可吸收線直徑有所增大

2.2 納米銀可吸收線組吻合口IL-6和TNF-α表達最低

各組動物手術(shù)操作順利，無吻合口漏和腹腔感染，小鼠術(shù)中無死亡。各組標本肉眼下無明顯異物反應(yīng)和線結(jié)所致的組織學(xué)硬塊。采用免疫組化方法觀察各組腸壁吻合口組織炎癥細胞因子IL-6和TNF-α的生成和表達情況，結(jié)果顯示：普通可吸收線組IL-6和TNF-α表達最高，納米銀可吸收線組吻合口IL-6和TNF-α表達最低(圖2、圖3)。半定量檢測結(jié)果進一步支持上述結(jié)果(表1)。

2.3 納米銀可吸收線組吻合口組織內(nèi)細胞增殖最活躍

PCNA免疫組化染色結(jié)果顯示：普通可吸收線組吻合口組織內(nèi)增殖細胞數(shù)量最少，納米銀可吸收線組吻合口組織內(nèi)增殖細胞數(shù)量最多(圖4)。半定量檢測結(jié)果進一步支持上述觀察結(jié)果(表1)。

3 討論

納米銀顆粒能有效破壞菌體蛋白和阻斷細菌呼吸鏈，從而具有顯著抑菌效果。此外，納米銀顆粒能有效抑制中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，因此具有良好抗炎特性，并成為近年來納米金屬顆粒領(lǐng)域研究熱點[5,12]。在前期研究中，我們將納米銀顆粒與具有抗炎作用的納米載體進行螯合，將螯合物局部應(yīng)用于燙傷介導(dǎo)的小鼠皮膚傷口創(chuàng)面，觀察到納米銀顆粒具有良好抗炎特性，并能有效促進炎癥性傷口組織修復(fù)和傷口愈合；與具有抗炎特性的納米載體進行螯合后，抗炎效果表現(xiàn)生物協(xié)同作用。我們進一步采用脂多糖刺激巨噬細胞來模擬體外炎癥環(huán)境，將巨噬細胞暴露于不同濃度納米銀溶液，細胞活力檢測證實納米銀顆粒對炎癥反應(yīng)的抑制并非由細胞毒性作用所介導(dǎo)[8]，這提示納米銀顆粒不是通過對炎癥細胞的毒性作用而實施抗炎作用。

表1 3組IL-6、TNF-α光密度(OD值)和PCNA陽性細胞數(shù)比較

本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步探討納米銀顆?？寡滋匦栽谵D(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。薇喬縫合線是臨床常用可吸收縫合線，我們通過組織工程學(xué)技術(shù)將納米銀顆粒涂層到薇喬縫合線表面，制備出納米銀可吸收縫合線，并在小鼠回腸切除模型上進行腸管端端吻合，觀察和比較該縫合線在吻合口組織內(nèi)介導(dǎo)的短期抗炎效果。研究證實納米銀可吸收縫合線吻合后的腸壁吻合口組織炎癥反應(yīng)輕微，其抗炎效果優(yōu)于傳統(tǒng)抗生素可吸收縫合線和普通可吸收縫合線；其抗炎效果也介導(dǎo)了吻合口組織內(nèi)細胞的增殖和組織修復(fù)。在這方面，Tian等[6]分別將納米銀溶液、相同質(zhì)量抗生素(阿莫西林+甲硝唑)混合液滴加到無菌紗布表面，將二者均分別覆蓋于小鼠背部深Ⅱ度皮膚燙傷創(chuàng)面(3 cm×2 cm)，結(jié)果顯示納米銀溶液組傷口愈合平均時間為25.2天，而抗菌縫線組為28.6天，組織學(xué)研究結(jié)果證實納米銀抗炎特性優(yōu)于抗菌縫線組。本研究結(jié)果與該結(jié)論一致，提示納米銀涂層可吸收縫合線的可行性，以及在腸壁吻合模型中具有良好短期抗炎效果。

圖2 3組腸壁吻合口冰凍組織免疫組化IL-6表達 圖3 3組腸壁吻合口冰凍組織免疫組化TNF-α表達 圖4 3組腸壁吻合口冰凍組織免疫組化PCNA表達

對于納米銀可吸收縫合線抗炎療效優(yōu)于三氯生可吸收縫合線，我們分析可能與以下因素有關(guān)：①納米銀顆粒本身介導(dǎo)的抗炎機制與抗生素抗炎機制存在差異；②納米銀顆粒本身能夠吸附和聚集外源性配體或糖蛋白，調(diào)控胞膜和胞漿內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因此，其可能通過調(diào)控炎癥細胞多個信號通路來抑制炎癥細胞因子或介質(zhì)釋放，從而表現(xiàn)出更滿意的抗炎特性；③縫合線質(zhì)地本身決定其表面抗生素在釋放的同時，也在不斷降解和被體液稀釋，以及被機體組織吸收，而縫合線表面釋放的納米銀顆粒在局部組織區(qū)域內(nèi)濃度能保持得相對持久，因此在短期內(nèi)表現(xiàn)出更滿意的抗炎效果；④本研究所使用的回腸腸切除腸吻合模型為感染性傷口，吻合口組織內(nèi)及周圍細菌耐藥質(zhì)粒對抗生素和納米銀顆粒敏感性存在差異。

后續(xù)研究我們將進一步對納米銀可吸收縫合線的遠期抗炎療效進行探討。由于正常腸壁組織吻合口完全修復(fù)的時間需2～3周，因此將在本研究基礎(chǔ)上，將收集標本的時間延長(本研究標本組織取材時間為術(shù)后第7天，后續(xù)研究將延長至術(shù)后14天和28天)，繼續(xù)觀察吻合口愈合晚期吻合口內(nèi)炎癥反應(yīng)程度、組織修復(fù)情況、腸壁修復(fù)過程中膠原蛋白沉淀、分布和排列情況、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的密度和比例，以及吻合口所能承載的最大爆破壓力等，以全面了解和評估納米銀涂層可吸收縫合線的轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛能。此外，我們將本研究中腸切除腸吻合動物模型更換為單純皮內(nèi)或器官壁內(nèi)縫合線線道模型，以進一步探討納米銀顆粒對縫合線穿行組織過程中所造成線道炎癥反應(yīng)的影響，以及組織內(nèi)打結(jié)之后，線結(jié)周圍異物反應(yīng)情況。

綜上，本研究成功將納米銀顆粒涂層于臨床常用的可吸收縫合線表面，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用于動物小腸腸切除腸吻合模型上，觀察到納米銀顆粒在吻合口處表現(xiàn)出明顯抗炎療效，并為吻合口帶來良好的細胞再生和組織修復(fù)效果。本研究也為后續(xù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的開展提供了較好的借鑒和理論依據(jù)。