食用菌中熒光增白劑高效液相色譜檢測方法研究

雷欣宇　付成平　仲伶俐　李曦　趙珊

摘 要：建立了同時測定食用菌中3種熒光增白劑（C.I.24，C.I. 210，C.I. 220）含量的高效液相色譜法。樣品前處理采用50% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液作提取劑，常溫超聲提取30 min。采用Sepax BR- C18柱為分析柱，以10 mmol·L-1甲酸銨水溶液和甲醇為流動相進行梯度洗脫，熒光激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為435 nm。結(jié)果顯示，3種熒光增白劑在1～200 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)相關系數(shù)均大于0.999，線性范圍較寬，線性關系良好；C.I.24檢出限為15 μg·kg-1，定量限為30.0 μg·kg-1，C.I.210和C.I.220檢出限為7.5 μg·kg-1，定量限為15.0 μg·kg-1；3種熒光增白劑不同添加水平的加標平均回收率在75.1%～108.1%，RSD在1.2%～14.4%。該方法操作簡便，結(jié)果準確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能夠適用于食用菌中熒光增白劑的檢測。

關鍵詞：熒光增白劑；食用菌；高效液相色譜

中圖分類號：O652.63 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.07.002

Study on Determination Method of Fluorescent Whitening Agents in Edible Fungi by HPLC

LEI Xinyu， FU Chengping， ZHONG Lingli， LI Xi， ZHAO Shan

（Analysis and Testing Center， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu， Sichuan 610066， China）

Abstract： A method for the determination of three kinds of fluorescent whitening agents（C.I.24， C.I. 210， C.I. 220）in edible fungi by HPLC was developed. The samples were extracted with 50% N， N-Dimethyl formamide-water solution by ultrasonic for 30 min at room temperature. The HPLC method was performed on a Sepax BR- C18 column， and 10 mmol·L-1 Ammonium formate and methanol were used as mobile phases in the gradient elution. Fluorescence detector was adopted in the excitation wavelength of 350 nm and emission wavelength of 435 nm. The results showed that the correlation coefficient of three kinds of fluorescent whitening agents in the range of concentration of 1 ～ 200 ng·mL-1 were greater than 0.999. The limit of detection of C.I.24 was 15 μg·kg-1， and the limit of quantification was 30.0 μg·kg-1， the limit of detection of C.I.210 and C.I.210 were 7.5 μg·kg-1， and the limit of quantification were 15.0 μg·kg-1. The average recoveries of three kinds of fluorescent whitening agents were in the range of 75.1%～108.1% at different spiked levels， and the RSD were in the range of 1.2%～14.4%. This method was simple， accurate， high sensitive and reproducible， and could be applied to the determination of fluorescent whitening agents in edible fungi.

Key word： fluorescent whitening agents； edible fungi； HPLC

熒光增白劑是一種熒光染料，它通過吸收不可見紫外光，再發(fā)射出可見藍光或藍紫色熒光，可使被染物品達到增白增艷的效果，被廣泛應用于紡織、紙張、洗滌劑、包裝等制造加工業(yè)[1]。除增白作用外，熒光增白劑還具有一定的防腐保鮮功能，因此市場上有不法商家將其添加到雙孢菇、海鮮菇等白色食用菌中，以使產(chǎn)品色亮好看，貨架期延長。另外，在包裝、運輸和銷售過程中，食用菌與包裝材料接觸也可能導致熒光增白劑污染。有報道稱，熒光增白劑被人體吸收后經(jīng)長期積累會有致癌風險[2]。雖然現(xiàn)在熒光增白劑對人體的危害問題尚無定論，但基于目前的試驗和研究水平，有必要對熒光增白劑的使用進行限制和監(jiān)管。

在我國，熒光增白劑被劃分為精細化工產(chǎn)品，嚴禁違法添加到農(nóng)產(chǎn)品中。國家衛(wèi)生標準也已明確規(guī)定，食品包裝用原紙、餐具洗滌劑、食品工具設備用洗滌劑與洗滌消毒劑中均不得檢出熒光性物質(zhì)。為保障消費者的健康安全，在加強對食用菌中熒光增白劑污染問題監(jiān)管力度的同時，研究和制定食用菌中熒光增白劑含量的測定方法有著重要的現(xiàn)實意義。目前，有關食用菌中熒光增白劑檢測方法并無相關國家標準，現(xiàn)行的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1257—2006只能作定性檢測，不能作定量檢測，在一定程度上限制了食用菌安全監(jiān)管效果。有關熒光增白劑檢測方法的研究也主要集中在食品包裝材料[3]、紙張[4]、洗滌劑[5]及塑料制品[6]等方面，關于食用菌的報道較少。有文獻報道[7]，采用離子對試劑進行液相檢測，能有效分離檢測3種熒光增白劑，但離子對試劑的使用會造成色譜柱不可逆的損傷，縮短其使用壽命；另有報道[8]，采用液質(zhì)聯(lián)用法，結(jié)果準確、靈敏度高，但該法質(zhì)譜設備成本高、操作技術要求高、固相萃取前處理步驟繁瑣，方法推廣有一定的局限性。

針對目前食用菌中熒光增白劑檢測標準不完善及食用菌安全日常監(jiān)管的需要，本文以市場上使用最多的二苯乙烯雙三嗪結(jié)構(gòu)型熒光增白劑為研究對象，前處理采用N，N-二甲基甲酰胺水溶液超聲提取（較固相萃取法簡便快捷，有效減少操作誤差，降低實驗成本），利用高效液相色譜-熒光檢測法進行分析，獲得快速、簡便、靈敏度高的檢測方法，旨在為食用菌中違禁添加熒光增白劑行為的監(jiān)管工作提供有力的技術支持。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 食用菌 供試食用菌為市售的新鮮雙孢菇、海鮮菇、雞腿菇、白玉菇。

1.1.2 試劑與儀器設備 甲醇為色譜純，美國Fisher公司；乙腈為色譜純，美國Fisher公司；甲酸銨為色譜純，美國Sigma公司；N，N-二甲基甲酰胺為分析純，西隴化工；氨水為分析純，濃度為25%～28%，西隴化工。熒光增白劑標準品（C.I.24，C.I. 210，C.I. 220）為100 μg·mL-1，福州綠川生物科技有限公司。

Agilent 1200高效液相色譜儀（配置熒光檢測器），美國Agilent公司；AUY220型分析天平，日本島津公司；TDZ5-WS離心機，長沙湘儀儀器有限公司；QIlinbeier渦旋混勻器， 海門市其林貝爾儀器制造有限公司； KQ5200DE超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.3 高效液相色譜條件 色譜柱為Sepax BR- C18柱（250.0 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，pH值適用范圍2～10）；流動相A相為10 mmol·L-1甲酸銨水溶液；B相為甲醇；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL；激發(fā)波長為350 nm；發(fā)射波長為435 nm；梯度洗脫條件如表1所示。

1.2 方 法

1.2.1 標準溶液的配制

1.2.1.1 標準儲備液（10 μg·mL-1） 精密移取適量熒光增白劑C.I.24、C.I. 210、C.I. 220標準品，用40%乙腈水溶液分別配制成濃度為10 μg·mL-1的儲備液，避光1～5 ℃保存，有效期90 d。

1.2.1.2 混合標準儲備液（C.I.24為2.0 μg·mL-1，C.I.210和C.I.220為1.0 μg·mL-1）分別移取2 mL C.I.24、1 mL C.I.210、1 mL C.I.220的上述3種標準儲備液，用40%乙腈水定容至10 mL，避光1～5 ℃保存，有效期30 d。

1.2.1.3 混合標準工作液 根據(jù)需要吸取適量混合標準儲備液，用40% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液稀釋至一定濃度（含C.I.24濃度為2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 ng·mL-1，C.I.210和C.I.220濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0， 50.0，100.0 ng·mL-1的系列標準溶液）。避光1～5 ℃保存，有效期7 d。

1.2.2 樣品前處理 稱取5 g試樣勻漿（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入30 mL的 50% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液渦旋混勻后，用氨水調(diào)節(jié)pH值至8，超聲30 min，在4 000 r·min-1下離心10 min。取1 mL上清液加0.25 mL水渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾至棕色進樣瓶，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件的確定

2.1.1 流動相的選擇 本試驗首先比較了液相中最常用的乙腈-水和甲醇-水2種流動相系統(tǒng)對3種熒光增白劑的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其分離效果和色譜峰峰形均不好，由于乙腈洗脫能力更強，目標物幾乎無保留?？紤]到這3種熒光增白劑均屬于含有磺酸基的二苯乙烯雙三嗪結(jié)構(gòu)的陰離子型化合物，在酸性條件下不穩(wěn)定，容易發(fā)生聚合和析出[8]，試驗采用甲酸銨水溶液和甲醇作為流動相，考察了不同濃度的緩沖液和不同梯度條件下的分離效果，結(jié)果表明，以10 mmol·L-1甲酸銨水溶液和甲醇作為流動相，按表1所述洗脫條件進行梯度洗脫可獲得滿意的信號響應和分離效果。

2.1.2 色譜柱的選擇 在相同色譜條件下，對比了CLOVERSIL C18 柱和Sepax BR- C18柱的分離效果，結(jié)果表明，二者均有很好的保留。但考慮到試驗條件偏堿性，為減小對色譜柱的傷害，延長色譜柱的壽命，試驗選用耐堿性更好的Sepax BR- C18柱（250.0 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，pH值適用范圍2～10）。3種熒光增白劑混合標液的色譜如圖1所示。

2.2 前處理條件的確定

2.2.1 提取溶劑的選擇 在查閱相關文獻的基礎上[9-10]，初步選用乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、三氯甲烷作為提取溶劑，選用雙孢菇陰性樣品加標進行回收試驗，結(jié)果表明，N，N-二甲基甲酰胺提取效果最好，其次為二甲亞砜，乙腈、甲醇幾乎無回收，因此，選擇N，N-二甲基甲酰胺作為提取溶劑。進一步對提取溶劑的濃度進行篩選，分別以20%，40%，50%，80%，100%的N，N-二甲基甲酰胺-水溶液為提取液，比較不同濃度N，N-二甲基甲酰胺溶液的提取效果，結(jié)果如圖2所示。隨著N，N-二甲基甲酰胺濃度的增加，提取回收率呈增加趨勢，當濃度達到50%以上后，回收率基本保持不變，考慮到高濃度的有機試劑對環(huán)境的污染和對實驗人員健康的不利，在保證提取效果的前提下，選用50%的N，N-二甲基甲酰胺作為提取溶劑。

2.2.2 溶劑效應的消除 當樣品溶液的溶劑強度強于流動相溶劑強度時，有可能出現(xiàn)目標峰展寬、分叉的現(xiàn)象，即溶劑效應。本方法中樣品提取溶劑為50%的N，N-二甲基甲酰胺，極性大于初始流動相，直接進樣檢測后發(fā)現(xiàn)，色譜峰變寬且出現(xiàn)分叉，嚴重影響了方法的準確度和靈敏度。為消除溶劑效應的影響，采用稀釋樣品溶劑濃度的方法改善峰形。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，當N，N-二甲基甲酰胺濃度不大于40%時，不再出現(xiàn)溶劑效應?？紤]到過度稀釋樣品液會降低方法靈敏度，在避免溶劑效應的前提下，選擇將樣品上機液濃度稀釋至40%。

2.2.3 提取液pH值的確定 分別用鹽酸和氨水調(diào)節(jié)提取液pH值至4，6，8，10，以未調(diào)pH值提取液為對照，選用雙孢菇陰性樣品加標進行回收試驗，比較不同pH值提取液對熒光增白劑提取效果的影響，結(jié)果表明（圖3），提取液pH值對回收率有顯著影響，其中，偏酸性提取液和對照組基本無回收；偏堿性提取液回收率顯著增加，當提取液pH值為8時回收率最高。因此，提取液pH值確定為8。

2.2.4 提取液用量的確定 分別考察了不同提取溶劑體積（15，20，25，30，40 mL）對雙孢菇加標樣品中3種熒光增白劑的提取效果，結(jié)果表明（圖4），增加提取溶劑體積有助于提升提取效果，當提取體積為30，40 mL時，3種熒光增白劑的回收率均較高，且二者間無顯著差異。為節(jié)省溶劑成本，減少環(huán)境污染，同時考慮到提取液用量增加會降低方法靈敏度，故選取提取溶劑體積為30 mL。

2.2.5 提取溫度和提取時間的確定 將雙孢菇加標樣品分別于室溫、40，50，60，70 ℃條件下超聲提取30 min，比較提取溫度對熒光增白劑提取效果的影響，結(jié)果表明（圖5），各個溫度下熒光增白劑的回收率間無顯著差異，說明提取效果幾乎不受溫度的影響。因此，選擇在常溫條件下提取。將加標樣品分別超聲提取15，30，60，120 min，比較超聲時間對提取效果的影響，結(jié)果表明，回收率在較短時間段內(nèi)增加明顯，在30 min時提取回收率最高；隨著提取時間繼續(xù)延長，提取回收率稍有下降（圖6），故選擇提取時間為30 min。

2.3 方法學考察

2.3.1 方法的線性范圍、檢出限與定量限 將系列混合標準工作液由低到高依次進樣檢測，以測得峰面積為縱坐標，以對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程和相關系數(shù)，結(jié)果表明，熒光增白劑標準工作液在1～200 ng·mL-1范圍內(nèi)相關系數(shù)均大于0.999，線性范圍較寬，線性關系良好。根據(jù)信噪比（S/N）>3為檢出限，信噪比（S/N）>10為定量限的原則，再根據(jù)前處理中稀釋倍數(shù)的換算，得出方法檢出限和方法定量限，結(jié)果如表2所示。

2.3.2 方法的回收率與精密度 對雙孢菇、海鮮菇、雞腿菇和白玉菇4種白色食用菌進行空白加標回收試驗。在空白樣品中添加適量熒光增白劑標準工作液，分別制成檢出限、5倍定量限和25倍定量限3個濃度水平的陽性樣品，每一水平進行6次平行測定，平均回收率與精密度如表3所示。由表3可知，3種熒光增白劑不同添加水平的平均回收率在75.1%～108.1%，RSD在1.2%～14.4%，其回收率和精密度均符合方法學要求，可用于食用菌中熒光增白劑C.I.24、C.I.210、C.I.220的檢測。

2.3.3 空白試驗 為確認樣品基質(zhì)對目標分析物是否存在干擾現(xiàn)象，將食用菌陰性試樣按本方法進行測定分析，結(jié)果表明，在目標分析物出峰位置沒有其他雜質(zhì)峰出現(xiàn)，即樣品基質(zhì)對所測分析物無干擾，試驗方法能滿足檢測要求。圖7、圖8分別為雙孢菇空白樣與加標樣的液相色譜結(jié)果。

3 結(jié) 論

本研究采用高效液相色譜-熒光檢測法建立了食用菌中3種熒光增白劑含量的檢測方法。該方法前處理簡便高效，方法線性范圍寬，線性關系良好，靈敏準確，精密度高，有效填補了目前食用菌中熒光增白劑檢測標準的技術空白，為維護消費者的身體健康和保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作提供了技術手段。

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