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2018-10-08 09:24:28陳娜高翔涂攀峰
熱帶農(nóng)業(yè)工程 2018年2期
陳娜 高翔 涂攀峰
摘 要 針對貴州煙草產(chǎn)區(qū)青枯病發(fā)病普遍和防治此病害研究不夠深入的現(xiàn)狀，本文通過田間試驗研究了施用不同量的鉀肥對煙草青枯病的防控效果，同時測定根系分泌物中的酚酸種類和含量，及其對煙草青枯病病原菌（Ralstonia solanacearum）的抑制作用，為農(nóng)業(yè)措施上防控病害提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，當(dāng)田間施用150 kg/hm2的鉀肥時，煙草青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)最低，根際土壤中青枯病原菌的數(shù)量最少，為5.6 log cfu/g，而無鉀肥處理的發(fā)病程度最高。同時，測定煙草根系分泌物中的酚酸發(fā)現(xiàn)，150 kg/hm2處理的肉桂酸、水楊酸和苯丙酸釋放量最高。外源添加酚酸對青枯病病原菌的生長結(jié)果表明，低濃度促進(jìn)了菌絲的生長，當(dāng)濃度達(dá)到600 mg/L時表現(xiàn)為抑制的作用。此外，在田間中施鉀肥顯著提高了煙草的生物量、鉀濃度和總酚含量。本研究結(jié)果表明，施用150 kg/hm2的鉀肥時，能在生產(chǎn)上有效的防控?zé)煵萸嗫莶?，其根系分泌物中的酚酸能顯著抑制致病菌的生長。
關(guān)鍵詞 煙草青枯病 ；鉀肥 ；發(fā)病率 ；酚酸 ；勞爾氏菌
中圖分類號 S572
Analysis on the Release of Phenolic Acids from Tobacco and Control of Tobacco Bacterial Wilt by Potassium Fertilizer
CHEN Na1，2） GAO Xiang3） TU Panfeng4） DENG Lansheng4）
（1 Guizhou Radio & TV University， Guiyang， Guizhou 550025；
2 Guizhou Vocational Technology Institute， Guiyang， Guizhou 550025；
3 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081；
4 College of Natural Resources and Environmental， South China Agricultural University，
Guangzhou， Guangdong 510642）
Abstract According to the situation of prevalence of tobacco bacterial wilt and its disease had not enough studied， the effect of different amount of potassium （K） fertilizer on tobacco bacterial wilt was studied by field experiment， the inhibitory effect of the potassium （K） fertilizer on Ralstonia solanacearum was determined， the content and varieties of phenolic acids were measured in order to provide reference for the control of tobacco bacterial wilt. The results showed that when the application amount of K fertilizer was 150 kg/hm2， the incidence and index of tobacco bacterial wilt were the lowest， the number of Ralstonia solanacearum in the rhizosphere soil was the least， which was 5.6 log cfu/g. The incidence of tobacco bacterial wilt was the highest without potassium （K） fertilizer. The amount of release of cinnamic acid， salicylic acid and phenylpropionic acid from 150 kg/hm2 were the highest. The growth effect of Exogenous phenolic acids on the Ralstonia solanacearum showed that low concentration promoted the growth， the inhibitory effect was achieved when the concentration reached 600 mg/L. In addition， K application significantly increased the tobacco biomass， K concentration and total phenol content in the field. The results showed that the application of 150 kg/hm2 of K fertilizer could effectively control tobacco bacterial wilt， the phenolic acids from root exudates could significantly inhibit the growth of Ralstonia solanacearum.
Key words Tobacco bacterial wilt ； potassium fertilizer ； disease incidence ； phenolic acids ； Ralstonia solanacearum
煙草（Nicotiana tabacum L）是茄科煙草屬經(jīng)濟(jì)作物，其主要種植在長江流域和西南地區(qū)[1-2]。處于中國西部地區(qū)的貴州省由于優(yōu)越的土地資源和水利條件，適宜煙草種植[2-3]，但長期連續(xù)種植煙草，以及氣溫高和空氣濕度大等環(huán)境因素，導(dǎo)致煙草病害發(fā)生嚴(yán)重，特別是難以防治的土傳病害，容易造成煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[3-4]。煙草青枯病是一種危害嚴(yán)重的土傳維管束病害，由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起，發(fā)病后煙草葉片支脈間出現(xiàn)黑色的斑紋，根系變黑腐爛，最終整棵植株葉片枯萎[4]。防治該病害主要是使用化學(xué)農(nóng)藥，雖然能控制病害的發(fā)生和傳播，但是過量的使用農(nóng)藥不但造成煙葉品質(zhì)的下降，還容易造成環(huán)境的污染問題[4-5]。因此，利用科學(xué)的施肥策略來防控病害的發(fā)生，對提高煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，以及維持煙草產(chǎn)業(yè)的持續(xù)性發(fā)展，具有重要的理論和實踐意義。
鉀是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一，參與植物生理過程中的各種生化反應(yīng)，還能增強(qiáng)植物在病蟲害、干旱、鹽害等脅迫下的抗逆能力[6-7]，也能調(diào)控植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（例如酚類）抵抗病原菌的侵染[7-8]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，施鉀肥能有效抑制檸檬流膠病、玉米莖腐病、山茱萸炭疽病和油菜黑斑病的發(fā)生[6-9]。目前研究鉀對植物的抗性機(jī)理主要在地上部分，但地下部根系是植物吸收營養(yǎng)和水分的主要器官[9-10]。而根系分泌物能為土壤微生物提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)，且分泌物中的酚酸物質(zhì)與連作障礙有密切的關(guān)系[10-11]。因此，本研究在前人研究基礎(chǔ)上，通過設(shè)置田間試驗，研究不同施鉀肥水平對煙草青枯病的防控效果，并鑒定煙草根系分泌物中酚酸的種類和含量，并測定這些酚酸對抑制煙草青枯病病原菌生長的影響。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗于2017年在貴州省畢節(jié)地區(qū)煙草種植試驗地進(jìn)行，土壤的基本理化形狀：pH 5.5，有機(jī)質(zhì)12.3 g/kg，速效氮114.8 mg/kg，速效磷13.9 mg/kg，速效鉀98.2 mg/kg。煙草移栽時間為2017年4月13日，煙草青枯病調(diào)查時間為7月8日。選用煙草品種為青枯病敏感品種DJY。
1.2 方法
1.2.1 試驗設(shè)計
田間試驗設(shè)置5個處理，分別為：K0無鉀肥；K75施用75 kg/hm2鉀肥；K150施用150 kg/hm2鉀肥；K225施用225 kg/hm2鉀肥；K300施用300 kg/hm2鉀肥，鉀肥為K2O。氮和磷的施用量為：氮肥100 kg/hm2，磷肥P2O5 75 kg/hm2。每個處理小區(qū)面積為64 m2，設(shè)置3個重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。田間管理參照當(dāng)?shù)責(zé)煵菰耘嗌a(chǎn)技術(shù)。
1.2.2 測定項目及方法
在調(diào)查煙草青枯病時，采取以下病害的分級方法：0級，煙草無病斑；1級，煙草莖部偶有褪色病斑，或有條斑一側(cè)有少數(shù)葉片凋萎；2級，莖部有黑色條斑，但尚未達(dá)到煙草頂部，或發(fā)病一側(cè)有半數(shù)以上葉片萎蔫；3級，煙草莖部的黑色條斑達(dá)到植株頂部，或病側(cè)有三分之二以上葉片凋萎；4級，植株基本枯死[12]。病情指數(shù)的計算方法：[（∑各級數(shù)×該級株數(shù)）/（最高等級數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）]×100[13]。每個處理取5個點進(jìn)行調(diào)查，每個點選取10株，一共調(diào)查50株煙草，逐一記載煙草病害分級。調(diào)查完煙草青枯病后，采集煙草植株進(jìn)行各指標(biāo)的檢測，主要包括：整株生物量，鉀和總酚含量，每個指標(biāo)為3次生物學(xué)重復(fù)。同時將煙草青枯病發(fā)病植株帶回實驗室進(jìn)行病害鑒定，以確定病原菌為Ralstonia solanacearum。同時采集煙草根際土樣品，每個處理隨機(jī)選取5株進(jìn)行根際土收集，樣品保存于4 ℃冰箱用于測定土壤中青枯病病原菌的數(shù)量，在SMSA培養(yǎng)基上進(jìn)行統(tǒng)計病原菌[12]。
測定指標(biāo)的主要方法：收獲的煙草樣品先在105 ℃下殺青30 min，然后于75 ℃下烘干至衡重后稱重為生物量；將樣品粉碎，利用H2SO4-H2O2進(jìn)行消煮，用火焰光度計法測定植株的鉀濃度；總酚含量的測定：取1 g樣品，加入5 mL含有1 % HCl的甲醇溶液，提取24 h，取0.l mL提取液稀釋，定容至5 mL搖勻，用分光光度計的280 nm處OD值為總酚含量。SMSA培養(yǎng)基用于根際土壤中煙草青枯病原菌數(shù)量的測定[12]。
煙草根系分泌物的收集及鑒定，在煙草種植30 d后從田間取出，用滅菌水清洗煙草根系，然后放入1 000 mL的塑料杯中放入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)24 h（16 h光/8 h黑暗），將塑料杯中的液體在冷凍干燥機(jī)中凍干待用，用于測定分泌物中的酚酸，每個處理3次重復(fù)。依據(jù)Ling等[14]研究方法，采用高效液相色譜 （HPLC，Agilent 1200，USA）進(jìn)行酚酸測定，通過外標(biāo)法計算出各酚酸在根系分泌物中的組成和含量。依據(jù)HPLC的結(jié)果，分別配置根系分泌物中的3種酚酸溶液，分別配制0、100、200、400、600 mg/L酚酸含量的培養(yǎng)基，測定3種酚酸溶液對病原菌生長的影響[12]。
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
用Excel 2016對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SAS9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 田間不同鉀肥施用量對煙草青枯病發(fā)病的影響
施鉀肥能顯著降低煙草青枯病害的發(fā)生（表1）。當(dāng)施鉀量為K150（150 kg/hm2）時，發(fā)病率和病情指數(shù)最低，K225（225 kg/hm2）處理次之，無鉀肥處理K0（0 kg/hm2）的最高。K150處理比K75（75 kg/hm2）和K0（0 kg/hm2）處理的發(fā)病率分別降低了24 %和34 %，病情指數(shù)分別降低32 %和20 %，但是施鉀量為K300（300 kg/hm2）時，其發(fā)病程度反而比K150處理增加。在煙草土壤根際土中的青枯病原菌含量上，K150處理的病原菌含量是最少的，比K0和K75分別降低了32 %和11 %，K0處理中青枯病原菌含量最高。說明施鉀能顯著的降低煙草青枯病害的發(fā)生，同時減少了病原菌在根際土壤中的含量，但并不是鉀肥施用越多，其發(fā)病程度就越低。
2.2 田間不同鉀肥施用量對煙草生物性狀的影響
施鉀顯著提高了煙草的生物量、鉀濃度和總酚的含量（表2）。煙草的生物量表現(xiàn)為K225最高，K300次之，K0最差。K225處理的煙草生物量比K0和K75處理分別顯著提高了94 %和57 %，但是K150與K225和K300處理之間生物量沒有顯著性差異，說明鉀肥需要適量的施用，并不是鉀肥施用量越大，其生物量就越高。在植株的鉀濃度和總酚含量的指標(biāo)上，當(dāng)鉀肥施用的量越多，植株的鉀濃度越高。K300處理的鉀濃度比K0和K75分別提高了60 %和23 %。在總酚含量上可看出，K150處理的總酚含量最高，但是與K225和K300處理之間差異不顯著，但這3個處理的總酚含量均顯著高于K0和K75處理。
2.3 田間不同鉀肥施用量對煙草根系分泌物中酚酸含量的影響
鉀水平顯著改變了煙草根系分泌物中酚酸的含量（表3）。在肉桂酸含量上，K150處理的含量是最高的，K225處理次之，K0含量最少。例如，K150處理的肉桂酸含量比K0和K75處理分別顯著提高了3.75倍和1.53倍。雖然K300處理的施鉀肥量是最高的，但與K150處理相比，還顯著的降低了肉桂酸的分泌量。在水楊酸含量上，K150處理的含量是最高的，但是K225和K300處理的含量與K150差異不顯著，但均顯著高于K0和K75處理的水楊酸含量，K150處理比K0和K75處理顯著提高了171 %和72 %。在苯丙酸含量上，K150處理的也是最高的，K225處理次之，K0含量最少。K150比K0和K75處理分別顯著提高了2.96倍和1.73倍。說明在田間施用不同量的鉀肥，能顯著調(diào)控?zé)煵莞捣置谖镏械姆铀岷?，而在K150處理中，肉桂酸、水楊酸和苯丙酸的含量均是最高的，K0處理最低。
2.4 添加不同濃度的酚酸對煙草青枯病病原菌菌絲干重的影響
由表4可知，添加不同濃度的酚酸對煙草青枯病病原菌菌絲干重有顯著的影響，均表現(xiàn)為低濃度的酚酸能促進(jìn)病原菌的生長，當(dāng)濃度高于400 mg/L時，表現(xiàn)為抑制的作用，當(dāng)濃度達(dá)到600 mg/L時，有顯著的抑制效果。在肉桂酸上，當(dāng)濃度為200 mg/L時，煙草青枯病病原菌菌絲干重比0 mg/L處理顯著提高了10 %，但比濃度為600 mg/L時抑制效果顯著降低了20 %。水楊酸和苯丙酸也有相同的趨勢，當(dāng)濃度為600 mg/L時抑制效果最明顯。
3 討論與結(jié)論
本研究證明了在田間施用適量的鉀肥（150 kg/hm2），能顯著的降低煙草青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)，同時病原菌在根際土壤中的含量最少（表1）。相對于其它的施鉀肥處理，K150處理的煙草青枯病發(fā)病程度最低，其主要是由于施鉀增加了煙草的生物量，提高植株的鉀濃度，以及與抗病相關(guān)的總酚含量（表2）。同時，施鉀調(diào)控了煙草根系分泌物中的酚酸物質(zhì)的含量，K150處理顯著增加了肉桂酸、水楊酸和苯丙酸的含量，其測定酚酸對煙草青枯病病原菌的影響時，表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)菌絲生長，而高濃度則抑制。而當(dāng)施鉀量超過150 kg/hm2時，并沒有顯著降低煙草青枯病的發(fā)生，反而有增加的趨勢，根系分泌物中的酚酸含量也有所降低，這證明了在田間施用鉀肥，應(yīng)該按照作物所需供肥，才能實現(xiàn)植株生物量和抵抗病害的最大化利益。
鉀元素具有提高植物抗逆境脅迫的功能，當(dāng)植物受到病原物侵染時，可通過調(diào)節(jié)酚類代謝來抵御病原菌的侵害，從而提高植物的抗病性[6-9，11，15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施鉀肥能顯著提高煙草對青枯病害的抵抗，施鉀肥后煙草通過提高植株中的總酚含量（表2），降低了煙草青枯病的發(fā)病嚴(yán)重程度（表1）。這與前人的研究報道相似，噴施鉀肥提高了小麥葉片中酚類物質(zhì)的含量，從而增強(qiáng)了小麥對白粉病的抵抗能力[16]；施鉀提高了棉花中的棉酚含量，而棉酚含量的提高則降低了黃萎病害的發(fā)生[17]。同時，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，田間施鉀可顯著增加了煙草的鉀濃度（表2），而鉀濃度的提高，可增加植物細(xì)胞壁的厚度，能在物理屏障上抵御病原菌的入侵[9，11]。在煙草根際中，K150處理的病原菌含量最少，這主要由于施鉀調(diào)控了煙草根系分泌物中的酚酸物質(zhì)（表3），酚類物質(zhì)的種類和濃度對根際土壤微生物的分布具有一定的影響，能促進(jìn)或抑制土傳病原菌的繁殖，可改變植物的根際微環(huán)境[13-15]。根系分泌物中的酚酸是重要的化感物質(zhì)，已有多種酚酸被證明能顯著的抑制病原菌的生長和繁殖[13-15]。這些酚酸物質(zhì)可以通過HPLC、GC/MS等儀器進(jìn)行分離鑒定，本研究通過HPLC鑒定出3種酚酸類物質(zhì)，分別為肉桂酸、水楊酸和苯丙酸（表3），并通過研究其對煙草青枯病病原菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)3種酚酸均呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)病原菌的生長，高濃度抑制的效果（表4）。這結(jié)果與譚秀梅等[18]的研究結(jié)果是相似的，其通過外源添加酚酸對土壤細(xì)菌、真菌和放線菌的影響，表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，而高濃度抑制微生物的生長。同時，Gao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源添加濃度為40 mg/L的肉桂酸時，能顯著抑制大豆紅冠根腐病病原菌的生長和產(chǎn)孢。Hao等[19]發(fā)現(xiàn)水楊酸顯著促進(jìn)西瓜枯萎病病原菌孢子的萌發(fā)，但濃度達(dá)到80 mg/L時卻抑制了孢子的萌發(fā)，其抑制率可達(dá)65 %。此外，水楊酸被認(rèn)為是植物抗性通路中的重要物質(zhì)，能提高植物對病原菌的抗性[19-20]。因此，推斷煙草根系分泌物中的酚酸物質(zhì)是抑制煙草青枯病發(fā)生的化感物質(zhì)之一。同時，施鉀提高作物對病害的抗性機(jī)制，并不是改變根系分泌物這一條途經(jīng)那么簡單，鉀對防治煙草病害的抗性機(jī)理有待深入探討。
本研究結(jié)果表明，在田間當(dāng)鉀肥施用量為150 kg/hm2時，能有效的降低煙草青枯病的發(fā)病程度，提高了植株的生物量、鉀濃度和總酚含量；也增加了根系分泌物中的肉桂酸、水楊酸和苯丙酸濃度，這些酚酸在濃度為600 mg/L時能顯著抑制煙草青枯病病原菌的生長。本研究對施鉀在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治煙草青枯病的發(fā)生提供了簡單可行的策略和理論依據(jù)。
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陳娜 高翔 涂攀峰
摘 要 針對貴州煙草產(chǎn)區(qū)青枯病發(fā)病普遍和防治此病害研究不夠深入的現(xiàn)狀，本文通過田間試驗研究了施用不同量的鉀肥對煙草青枯病的防控效果，同時測定根系分泌物中的酚酸種類和含量，及其對煙草青枯病病原菌（Ralstonia solanacearum）的抑制作用，為農(nóng)業(yè)措施上防控病害提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，當(dāng)田間施用150 kg/hm2的鉀肥時，煙草青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)最低，根際土壤中青枯病原菌的數(shù)量最少，為5.6 log cfu/g，而無鉀肥處理的發(fā)病程度最高。同時，測定煙草根系分泌物中的酚酸發(fā)現(xiàn)，150 kg/hm2處理的肉桂酸、水楊酸和苯丙酸釋放量最高。外源添加酚酸對青枯病病原菌的生長結(jié)果表明，低濃度促進(jìn)了菌絲的生長，當(dāng)濃度達(dá)到600 mg/L時表現(xiàn)為抑制的作用。此外，在田間中施鉀肥顯著提高了煙草的生物量、鉀濃度和總酚含量。本研究結(jié)果表明，施用150 kg/hm2的鉀肥時，能在生產(chǎn)上有效的防控?zé)煵萸嗫莶?，其根系分泌物中的酚酸能顯著抑制致病菌的生長。
關(guān)鍵詞 煙草青枯病 ；鉀肥 ；發(fā)病率 ；酚酸 ；勞爾氏菌
中圖分類號 S572
Analysis on the Release of Phenolic Acids from Tobacco and Control of Tobacco Bacterial Wilt by Potassium Fertilizer
CHEN Na1，2） GAO Xiang3） TU Panfeng4） DENG Lansheng4）
（1 Guizhou Radio & TV University， Guiyang， Guizhou 550025；
2 Guizhou Vocational Technology Institute， Guiyang， Guizhou 550025；
3 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081；
4 College of Natural Resources and Environmental， South China Agricultural University，
Guangzhou， Guangdong 510642）
Abstract According to the situation of prevalence of tobacco bacterial wilt and its disease had not enough studied， the effect of different amount of potassium （K） fertilizer on tobacco bacterial wilt was studied by field experiment， the inhibitory effect of the potassium （K） fertilizer on Ralstonia solanacearum was determined， the content and varieties of phenolic acids were measured in order to provide reference for the control of tobacco bacterial wilt. The results showed that when the application amount of K fertilizer was 150 kg/hm2， the incidence and index of tobacco bacterial wilt were the lowest， the number of Ralstonia solanacearum in the rhizosphere soil was the least， which was 5.6 log cfu/g. The incidence of tobacco bacterial wilt was the highest without potassium （K） fertilizer. The amount of release of cinnamic acid， salicylic acid and phenylpropionic acid from 150 kg/hm2 were the highest. The growth effect of Exogenous phenolic acids on the Ralstonia solanacearum showed that low concentration promoted the growth， the inhibitory effect was achieved when the concentration reached 600 mg/L. In addition， K application significantly increased the tobacco biomass， K concentration and total phenol content in the field. The results showed that the application of 150 kg/hm2 of K fertilizer could effectively control tobacco bacterial wilt， the phenolic acids from root exudates could significantly inhibit the growth of Ralstonia solanacearum.
Key words Tobacco bacterial wilt ； potassium fertilizer ； disease incidence ； phenolic acids ； Ralstonia solanacearum
煙草（Nicotiana tabacum L）是茄科煙草屬經(jīng)濟(jì)作物，其主要種植在長江流域和西南地區(qū)[1-2]。處于中國西部地區(qū)的貴州省由于優(yōu)越的土地資源和水利條件，適宜煙草種植[2-3]，但長期連續(xù)種植煙草，以及氣溫高和空氣濕度大等環(huán)境因素，導(dǎo)致煙草病害發(fā)生嚴(yán)重，特別是難以防治的土傳病害，容易造成煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[3-4]。煙草青枯病是一種危害嚴(yán)重的土傳維管束病害，由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起，發(fā)病后煙草葉片支脈間出現(xiàn)黑色的斑紋，根系變黑腐爛，最終整棵植株葉片枯萎[4]。防治該病害主要是使用化學(xué)農(nóng)藥，雖然能控制病害的發(fā)生和傳播，但是過量的使用農(nóng)藥不但造成煙葉品質(zhì)的下降，還容易造成環(huán)境的污染問題[4-5]。因此，利用科學(xué)的施肥策略來防控病害的發(fā)生，對提高煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，以及維持煙草產(chǎn)業(yè)的持續(xù)性發(fā)展，具有重要的理論和實踐意義。
鉀是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一，參與植物生理過程中的各種生化反應(yīng)，還能增強(qiáng)植物在病蟲害、干旱、鹽害等脅迫下的抗逆能力[6-7]，也能調(diào)控植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（例如酚類）抵抗病原菌的侵染[7-8]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，施鉀肥能有效抑制檸檬流膠病、玉米莖腐病、山茱萸炭疽病和油菜黑斑病的發(fā)生[6-9]。目前研究鉀對植物的抗性機(jī)理主要在地上部分，但地下部根系是植物吸收營養(yǎng)和水分的主要器官[9-10]。而根系分泌物能為土壤微生物提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)，且分泌物中的酚酸物質(zhì)與連作障礙有密切的關(guān)系[10-11]。因此，本研究在前人研究基礎(chǔ)上，通過設(shè)置田間試驗，研究不同施鉀肥水平對煙草青枯病的防控效果，并鑒定煙草根系分泌物中酚酸的種類和含量，并測定這些酚酸對抑制煙草青枯病病原菌生長的影響。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗于2017年在貴州省畢節(jié)地區(qū)煙草種植試驗地進(jìn)行，土壤的基本理化形狀：pH 5.5，有機(jī)質(zhì)12.3 g/kg，速效氮114.8 mg/kg，速效磷13.9 mg/kg，速效鉀98.2 mg/kg。煙草移栽時間為2017年4月13日，煙草青枯病調(diào)查時間為7月8日。選用煙草品種為青枯病敏感品種DJY。
1.2 方法
1.2.1 試驗設(shè)計
田間試驗設(shè)置5個處理，分別為：K0無鉀肥；K75施用75 kg/hm2鉀肥；K150施用150 kg/hm2鉀肥；K225施用225 kg/hm2鉀肥；K300施用300 kg/hm2鉀肥，鉀肥為K2O。氮和磷的施用量為：氮肥100 kg/hm2，磷肥P2O5 75 kg/hm2。每個處理小區(qū)面積為64 m2，設(shè)置3個重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。田間管理參照當(dāng)?shù)責(zé)煵菰耘嗌a(chǎn)技術(shù)。
1.2.2 測定項目及方法
在調(diào)查煙草青枯病時，采取以下病害的分級方法：0級，煙草無病斑；1級，煙草莖部偶有褪色病斑，或有條斑一側(cè)有少數(shù)葉片凋萎；2級，莖部有黑色條斑，但尚未達(dá)到煙草頂部，或發(fā)病一側(cè)有半數(shù)以上葉片萎蔫；3級，煙草莖部的黑色條斑達(dá)到植株頂部，或病側(cè)有三分之二以上葉片凋萎；4級，植株基本枯死[12]。病情指數(shù)的計算方法：[（∑各級數(shù)×該級株數(shù)）/（最高等級數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）]×100[13]。每個處理取5個點進(jìn)行調(diào)查，每個點選取10株，一共調(diào)查50株煙草，逐一記載煙草病害分級。調(diào)查完煙草青枯病后，采集煙草植株進(jìn)行各指標(biāo)的檢測，主要包括：整株生物量，鉀和總酚含量，每個指標(biāo)為3次生物學(xué)重復(fù)。同時將煙草青枯病發(fā)病植株帶回實驗室進(jìn)行病害鑒定，以確定病原菌為Ralstonia solanacearum。同時采集煙草根際土樣品，每個處理隨機(jī)選取5株進(jìn)行根際土收集，樣品保存于4 ℃冰箱用于測定土壤中青枯病病原菌的數(shù)量，在SMSA培養(yǎng)基上進(jìn)行統(tǒng)計病原菌[12]。
測定指標(biāo)的主要方法：收獲的煙草樣品先在105 ℃下殺青30 min，然后于75 ℃下烘干至衡重后稱重為生物量；將樣品粉碎，利用H2SO4-H2O2進(jìn)行消煮，用火焰光度計法測定植株的鉀濃度；總酚含量的測定：取1 g樣品，加入5 mL含有1 % HCl的甲醇溶液，提取24 h，取0.l mL提取液稀釋，定容至5 mL搖勻，用分光光度計的280 nm處OD值為總酚含量。SMSA培養(yǎng)基用于根際土壤中煙草青枯病原菌數(shù)量的測定[12]。
煙草根系分泌物的收集及鑒定，在煙草種植30 d后從田間取出，用滅菌水清洗煙草根系，然后放入1 000 mL的塑料杯中放入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)24 h（16 h光/8 h黑暗），將塑料杯中的液體在冷凍干燥機(jī)中凍干待用，用于測定分泌物中的酚酸，每個處理3次重復(fù)。依據(jù)Ling等[14]研究方法，采用高效液相色譜 （HPLC，Agilent 1200，USA）進(jìn)行酚酸測定，通過外標(biāo)法計算出各酚酸在根系分泌物中的組成和含量。依據(jù)HPLC的結(jié)果，分別配置根系分泌物中的3種酚酸溶液，分別配制0、100、200、400、600 mg/L酚酸含量的培養(yǎng)基，測定3種酚酸溶液對病原菌生長的影響[12]。
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
用Excel 2016對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SAS9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 田間不同鉀肥施用量對煙草青枯病發(fā)病的影響
施鉀肥能顯著降低煙草青枯病害的發(fā)生（表1）。當(dāng)施鉀量為K150（150 kg/hm2）時，發(fā)病率和病情指數(shù)最低，K225（225 kg/hm2）處理次之，無鉀肥處理K0（0 kg/hm2）的最高。K150處理比K75（75 kg/hm2）和K0（0 kg/hm2）處理的發(fā)病率分別降低了24 %和34 %，病情指數(shù)分別降低32 %和20 %，但是施鉀量為K300（300 kg/hm2）時，其發(fā)病程度反而比K150處理增加。在煙草土壤根際土中的青枯病原菌含量上，K150處理的病原菌含量是最少的，比K0和K75分別降低了32 %和11 %，K0處理中青枯病原菌含量最高。說明施鉀能顯著的降低煙草青枯病害的發(fā)生，同時減少了病原菌在根際土壤中的含量，但并不是鉀肥施用越多，其發(fā)病程度就越低。
2.2 田間不同鉀肥施用量對煙草生物性狀的影響
施鉀顯著提高了煙草的生物量、鉀濃度和總酚的含量（表2）。煙草的生物量表現(xiàn)為K225最高，K300次之，K0最差。K225處理的煙草生物量比K0和K75處理分別顯著提高了94 %和57 %，但是K150與K225和K300處理之間生物量沒有顯著性差異，說明鉀肥需要適量的施用，并不是鉀肥施用量越大，其生物量就越高。在植株的鉀濃度和總酚含量的指標(biāo)上，當(dāng)鉀肥施用的量越多，植株的鉀濃度越高。K300處理的鉀濃度比K0和K75分別提高了60 %和23 %。在總酚含量上可看出，K150處理的總酚含量最高，但是與K225和K300處理之間差異不顯著，但這3個處理的總酚含量均顯著高于K0和K75處理。
2.3 田間不同鉀肥施用量對煙草根系分泌物中酚酸含量的影響
鉀水平顯著改變了煙草根系分泌物中酚酸的含量（表3）。在肉桂酸含量上，K150處理的含量是最高的，K225處理次之，K0含量最少。例如，K150處理的肉桂酸含量比K0和K75處理分別顯著提高了3.75倍和1.53倍。雖然K300處理的施鉀肥量是最高的，但與K150處理相比，還顯著的降低了肉桂酸的分泌量。在水楊酸含量上，K150處理的含量是最高的，但是K225和K300處理的含量與K150差異不顯著，但均顯著高于K0和K75處理的水楊酸含量，K150處理比K0和K75處理顯著提高了171 %和72 %。在苯丙酸含量上，K150處理的也是最高的，K225處理次之，K0含量最少。K150比K0和K75處理分別顯著提高了2.96倍和1.73倍。說明在田間施用不同量的鉀肥，能顯著調(diào)控?zé)煵莞捣置谖镏械姆铀岷?，而在K150處理中，肉桂酸、水楊酸和苯丙酸的含量均是最高的，K0處理最低。
2.4 添加不同濃度的酚酸對煙草青枯病病原菌菌絲干重的影響
由表4可知，添加不同濃度的酚酸對煙草青枯病病原菌菌絲干重有顯著的影響，均表現(xiàn)為低濃度的酚酸能促進(jìn)病原菌的生長，當(dāng)濃度高于400 mg/L時，表現(xiàn)為抑制的作用，當(dāng)濃度達(dá)到600 mg/L時，有顯著的抑制效果。在肉桂酸上，當(dāng)濃度為200 mg/L時，煙草青枯病病原菌菌絲干重比0 mg/L處理顯著提高了10 %，但比濃度為600 mg/L時抑制效果顯著降低了20 %。水楊酸和苯丙酸也有相同的趨勢，當(dāng)濃度為600 mg/L時抑制效果最明顯。
3 討論與結(jié)論
本研究證明了在田間施用適量的鉀肥（150 kg/hm2），能顯著的降低煙草青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)，同時病原菌在根際土壤中的含量最少（表1）。相對于其它的施鉀肥處理，K150處理的煙草青枯病發(fā)病程度最低，其主要是由于施鉀增加了煙草的生物量，提高植株的鉀濃度，以及與抗病相關(guān)的總酚含量（表2）。同時，施鉀調(diào)控了煙草根系分泌物中的酚酸物質(zhì)的含量，K150處理顯著增加了肉桂酸、水楊酸和苯丙酸的含量，其測定酚酸對煙草青枯病病原菌的影響時，表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)菌絲生長，而高濃度則抑制。而當(dāng)施鉀量超過150 kg/hm2時，并沒有顯著降低煙草青枯病的發(fā)生，反而有增加的趨勢，根系分泌物中的酚酸含量也有所降低，這證明了在田間施用鉀肥，應(yīng)該按照作物所需供肥，才能實現(xiàn)植株生物量和抵抗病害的最大化利益。
鉀元素具有提高植物抗逆境脅迫的功能，當(dāng)植物受到病原物侵染時，可通過調(diào)節(jié)酚類代謝來抵御病原菌的侵害，從而提高植物的抗病性[6-9，11，15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施鉀肥能顯著提高煙草對青枯病害的抵抗，施鉀肥后煙草通過提高植株中的總酚含量（表2），降低了煙草青枯病的發(fā)病嚴(yán)重程度（表1）。這與前人的研究報道相似，噴施鉀肥提高了小麥葉片中酚類物質(zhì)的含量，從而增強(qiáng)了小麥對白粉病的抵抗能力[16]；施鉀提高了棉花中的棉酚含量，而棉酚含量的提高則降低了黃萎病害的發(fā)生[17]。同時，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，田間施鉀可顯著增加了煙草的鉀濃度（表2），而鉀濃度的提高，可增加植物細(xì)胞壁的厚度，能在物理屏障上抵御病原菌的入侵[9，11]。在煙草根際中，K150處理的病原菌含量最少，這主要由于施鉀調(diào)控了煙草根系分泌物中的酚酸物質(zhì)（表3），酚類物質(zhì)的種類和濃度對根際土壤微生物的分布具有一定的影響，能促進(jìn)或抑制土傳病原菌的繁殖，可改變植物的根際微環(huán)境[13-15]。根系分泌物中的酚酸是重要的化感物質(zhì)，已有多種酚酸被證明能顯著的抑制病原菌的生長和繁殖[13-15]。這些酚酸物質(zhì)可以通過HPLC、GC/MS等儀器進(jìn)行分離鑒定，本研究通過HPLC鑒定出3種酚酸類物質(zhì)，分別為肉桂酸、水楊酸和苯丙酸（表3），并通過研究其對煙草青枯病病原菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)3種酚酸均呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)病原菌的生長，高濃度抑制的效果（表4）。這結(jié)果與譚秀梅等[18]的研究結(jié)果是相似的，其通過外源添加酚酸對土壤細(xì)菌、真菌和放線菌的影響，表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，而高濃度抑制微生物的生長。同時，Gao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源添加濃度為40 mg/L的肉桂酸時，能顯著抑制大豆紅冠根腐病病原菌的生長和產(chǎn)孢。Hao等[19]發(fā)現(xiàn)水楊酸顯著促進(jìn)西瓜枯萎病病原菌孢子的萌發(fā)，但濃度達(dá)到80 mg/L時卻抑制了孢子的萌發(fā)，其抑制率可達(dá)65 %。此外，水楊酸被認(rèn)為是植物抗性通路中的重要物質(zhì)，能提高植物對病原菌的抗性[19-20]。因此，推斷煙草根系分泌物中的酚酸物質(zhì)是抑制煙草青枯病發(fā)生的化感物質(zhì)之一。同時，施鉀提高作物對病害的抗性機(jī)制，并不是改變根系分泌物這一條途經(jīng)那么簡單，鉀對防治煙草病害的抗性機(jī)理有待深入探討。
本研究結(jié)果表明，在田間當(dāng)鉀肥施用量為150 kg/hm2時，能有效的降低煙草青枯病的發(fā)病程度，提高了植株的生物量、鉀濃度和總酚含量；也增加了根系分泌物中的肉桂酸、水楊酸和苯丙酸濃度，這些酚酸在濃度為600 mg/L時能顯著抑制煙草青枯病病原菌的生長。本研究對施鉀在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治煙草青枯病的發(fā)生提供了簡單可行的策略和理論依據(jù)。
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