1 株產(chǎn)單寧酶嗜熱真菌的鑒定、酶學(xué)性質(zhì)分析及碳水化合物活性酶表達(dá)

谷新晰，盧海強，劉亞娟，陳賽娟，谷子林，孟祥晨，陳寶江,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)山區(qū)研究所，河北 保定 071000；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北 保定 071000）

單寧酶（EC 3.1.1.20）是一類降解單寧中酯鍵和縮酚酸鍵的水解酶，廣泛分布在植物和微生物中[1-2]。其底物單寧作為一種天然大分子物質(zhì)存在于植物的莖、根和果實當(dāng)中。因作為食品加工原料的果實含有單寧，往往具有苦澀味，這使得柿子、刺梨等高含量單寧水果生產(chǎn)加工時需要進(jìn)行脫澀處理[3-4]。采用乙醇脫澀、乙烯脫澀及加熱脫澀等傳統(tǒng)方法進(jìn)行脫澀處理，達(dá)到了一定的效果，但是產(chǎn)品在加工處理過程中會出現(xiàn)返澀現(xiàn)象[5-6]。利用單寧酶脫澀法不僅可以避免上述現(xiàn)象的發(fā)生，同時還可以提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性[7-9]。單寧酶較高的價格限制了其在食品領(lǐng)域應(yīng)用的范圍，豐富單寧酶資源具有較強的現(xiàn)實意義。

嗜熱真菌是一類能夠在45 ℃以上正常生長，而在19 ℃以下無法生長的真核微生物[10]。嗜熱真菌所分泌酶類大部分為嗜熱酶[11]，因其具有較高的催化反應(yīng)溫度及良好的穩(wěn)定性能，在食品、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域方面應(yīng)用前景廣闊[12-13]。目前，嗜熱真菌來源的單寧酶研究鮮有報道。碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）是一類降碳解水化合物酶類的總稱[14]，大多數(shù)食品原料含有淀粉、纖維素、果膠類等物質(zhì)，這使得降解這些物質(zhì)酶在食品工業(yè)中發(fā)揮著越來越重要的作用。因此，CAZymes酶譜分析是對菌株應(yīng)用潛力的重要指標(biāo)，傳統(tǒng)的酶譜分析策略無法全面對菌株酶譜分析。隨著現(xiàn)代轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)開展菌株產(chǎn)酶譜的研究成為新的策略。

本課題組前期從大曲中分離、篩選獲得1 株產(chǎn)單寧酶的嗜熱真菌HBHF5，本研究旨在對菌株HBHF5進(jìn)行鑒定及酶學(xué)特性的相關(guān)研究；利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對該菌株糖苷水解酶譜進(jìn)行分析，掌握菌株的產(chǎn)酶性能，為尋找新型單寧酶及其他食品酶的開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株HBHF5篩選自河北保定劉伶醉釀酒股份有限公司大曲粉，并保存于本實驗室。

牛肉膏、蛋白胨等均為國產(chǎn)分析純；Trizol、氯仿-異戊醇（24∶1，V/V） 北京索萊寶科技有限公司；單寧酸 美國Sigma公司；真菌DNA提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)試劑北京全式金生物技術(shù)有限公司。

基礎(chǔ)鹽溶液：NH4NO311 g，MgSO4·7H2O 1 g，NaCl 0.1 g，溶于100 mL水，用于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮5 g，單寧酸10 mg，基礎(chǔ)鹽溶液5 mL，放置于250 mL錐形瓶中，混勻，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮1.5 g，單寧酸150 mg，基礎(chǔ)鹽溶液150 mL，放置于250 mL錐形瓶中，混勻，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

CX31光學(xué)顯微鏡 日本Colmpus公司；GL-2M離心機上海市離心機械研究所；ABI 9700 PCR儀 美國Applied Biosystems公司；凝膠成像儀分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；立式高速低溫離心機 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的鑒定

1.3.1.1 菌落形態(tài)特征觀察

將菌株HBHF5點植在PDA平板中，45 ℃倒置培養(yǎng)，觀察并記錄菌落形狀、大小、生長速率、是否產(chǎn)色素等，對照真菌鑒定手冊[15]，初步確定菌株的種屬地位。

1.3.1.2 ITS序列分子鑒定

菌株HBHF5基因組DNA提取采用CTAB法；ITS序列PCR擴增參數(shù)及體系參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行，純化后的PCR擴增產(chǎn)物由華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測序；將獲得的測序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.gov/blast/）進(jìn)行BLAST同源性分析，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析。

1.3.2 生長曲線的測定

采用菌體干重法測定菌株生長曲線。菌株孢子懸浮液接種于50 mL PDB培養(yǎng)基中，45 ℃搖床培養(yǎng)，分別在12、24、36、48、60 h和72 h取樣，過濾獲得菌絲體，在105 ℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，測定菌體質(zhì)量，繪制菌株的生長曲線。

1.3.3 單寧酶活力的測定

粗酶液的制備：菌株HBHF5種子接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在45 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h后，發(fā)酵液離心處理（12 000 r/min，10 min），收集上清液，即為粗酶液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

單寧酶活力測定參考Sharma等[17]方法。取100 μL適當(dāng)稀釋酶液與400 μL沒食子酸丙酯溶液（1.25 mmol/L，pH 5.0）混勻，60 ℃反應(yīng)10 min后，加入300 μL羅丹寧終止反應(yīng)，并加入200 μL KOH（0.5 mmol/L）溶液進(jìn)行顯色，在520 nm波長處測定其吸光度，并計算酶活力。以每分鐘水解沒食子酸丙酯底物產(chǎn)成1 μmol沒食子酸所需酶量定義為1 個酶活力單位（U）。

1.3.4 固態(tài)培養(yǎng)和液態(tài)培養(yǎng)對菌株HBHF5產(chǎn)酶的影響

將菌株HBHF5種子接種于液體或固態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，45 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d后收集液體發(fā)酵培養(yǎng)液，離心處理收獲上清液為樣品1（SSF1），菌體進(jìn)行超聲波破碎為樣品2（SSF2）；固態(tài)發(fā)酵浸出液為樣品3（SmF1），固態(tài)發(fā)酵菌體超聲波破碎液為樣品4（SmF2），分別對4 種樣品進(jìn)行單寧酶活力的測定，探究該菌單寧酶的在固液兩種培養(yǎng)方式對產(chǎn)酶的影響。

1.3.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.5.1 最適反應(yīng)pH值的測定

將酶液在不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）條件下與底物反應(yīng)，按照1.3.3節(jié)方法測定酶活力，以最高酶活力為100%，測定酶最適反應(yīng)pH值。

1.3.5.2 最適反應(yīng)溫度的測定

在最適pH值條件下，將酶液在不同溫度（20、30、40、50、60、70、80 ℃）與底物進(jìn)行反應(yīng)，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活力，以最高酶活力為100%，測定酶最適反應(yīng)溫度。

1.3.5.3 熱穩(wěn)定性的測定

在最適pH值條件下，將酶液分別在50、60 ℃和70 ℃處理不同時間（0、2、5、10、20、30 min和60 min），以最高酶活力為100%，測定剩余酶活力，研究單寧酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.5.4 金屬離子對酶活力的影響

通過在酶反應(yīng)體系中加入終濃度為1、5 mmol/L的金屬離子（Cu2＋、Fe3＋、Mn2＋、Ca2＋、Mg2＋、Li＋、K＋、Na＋和Zn2＋）研究其對酶活力的影響。以未經(jīng)過添加任何金屬離子的反應(yīng)為對照組，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活力測定方法測定其剩余酶活力。

1.3.6 CAZymes基因表達(dá)分析

菌株HBHF5接入液態(tài)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，45 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后離心收集菌體。采用Trizol方法提取總RNA，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer和Agilent RNA 6000 Nano Kit對RNA濃度與完整性進(jìn)行測定分析，純度采用凱奧K5500微量分光光度計來測定。取3 μg總RNA樣品，利用Ribo-Zero-magnetic-kit對樣品mRNA進(jìn)行富集，通過Fragmentation buffer試劑對mRNA進(jìn)行片段化處理，并以此為模板構(gòu)建表達(dá)文庫。

采用HiseqTM2500測序平臺進(jìn)行雙端測序，獲得100 bp左右測序reads。對獲得的原始測序序列進(jìn)行分析，去除只含有接頭或過短的序列數(shù)據(jù)。利用軟件TOPHAT（v2.0.6）將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)與參考Ensembl真菌數(shù)據(jù)庫Aspergillus fumigatus.CADRE.33基因組序列進(jìn)行比對獲得基因的注釋信息。依據(jù)CAZymes數(shù)據(jù)庫（http://www.cazy.org/）分類標(biāo)準(zhǔn)，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均設(shè)3 次重復(fù)，取平均值，運用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件對試驗數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

圖1 HBHF5菌株菌落特征（A）及系統(tǒng)發(fā)育樹（B）Fig. 1 Cultural characteristics (A) and phylogenetic tree (B) of strain HBHF5

如圖1A所示，菌株HBHF5在45 ℃條件下生長旺盛，培養(yǎng)3 d菌落即可鋪滿整個平皿，在 PDA平板中的菌落緊密，表面粗糙，菌落中心突起，邊緣為輻射狀褶痕；菌株生長初期時，菌落顏色為白色，隨后菌落逐漸成為藍(lán)綠色，在生長后期，菌落顏色為淺灰色，呈粉末狀。分生孢子頭頂囊呈燒瓶狀，分生孢子梗單層，成木柵狀排列狀布滿頂囊，孢子成球形，綠色。

如圖1B所示，菌株HBHF5 ITS序列經(jīng)BLAST比對分析，菌株HBHF5與煙曲霉（Aspergillus fumigatus AF293）一致性為99%，且在進(jìn)化樹中位于同一個分支中，即具有較近的親緣關(guān)系。

綜上所述，菌株HBHF5經(jīng)形態(tài)觀察和分子鑒定結(jié)果，該菌屬于曲霉屬，煙曲霉種，最終命名為煙曲霉HBHF5（A. fumigatus HBHF5）。

2.2 菌株生長曲線的測定

圖2 HBHF5菌株生長曲線Fig. 2 Growth curve of strain HBHF5

A. fumigatus HBHF5生長變化情況如圖2所示，該菌以體積分?jǐn)?shù)1%接菌培養(yǎng)時延滯期時間為12 h，菌株培養(yǎng)24 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，大約持續(xù)生長36 h，即在培養(yǎng)60 h后達(dá)到生長穩(wěn)定期。同時通過對單寧酶活力測定分析，發(fā)現(xiàn)該菌在對數(shù)培養(yǎng)時期即開始進(jìn)行產(chǎn)酶，隨著菌株自身的生長，產(chǎn)酶量也隨之增加，直至對數(shù)生長周期，單寧酶產(chǎn)酶量達(dá)到最大值，其酶活力為136 U/mL。以上結(jié)果表明A. fumigatus HBHF5菌株在45 ℃條件下生長迅速，能夠短周期發(fā)酵生產(chǎn)即可獲得單寧酶產(chǎn)物。

2.3 菌株產(chǎn)酶特性及酶學(xué)性質(zhì)分析

通過對比分析研究固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵方式下A. fumigatus HBHF5產(chǎn)單寧酶差異，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)方式對該菌的產(chǎn)酶影響較大。A. fumigatus HBHF5在固態(tài)培養(yǎng)條件下幾乎不合成單寧酶，而在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)時可產(chǎn)生大量的單寧酶，且以胞外分泌形式為主（94%）（圖3）。這與已報道大多數(shù)生產(chǎn)單寧酶菌株的產(chǎn)酶方式不同，該特性使得A. fumigatus HBHF5可以采用液態(tài)深層發(fā)酵方式生產(chǎn)單寧酶。

圖3 培養(yǎng)方式對A. fumigatus HBHF5產(chǎn)單寧酶的影響Fig. 3 Effect of culture systems on tannase production of strain HBHF5

經(jīng)測定，該單寧酶在pH值為6.0時，酶活力最高。在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)，能夠維持60%以上的酶活力（圖4A），具有一定的pH值適應(yīng)性，能夠滿足多種原料加工生產(chǎn)中的需求。該單寧酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在70 ℃時依然具有50%以上的酶活力，在20 ℃反應(yīng)時，該單寧酶能維持大約57%的酶活力（圖4B），該酶屬于嗜熱酶。

在酶熱穩(wěn)定性的研究中發(fā)現(xiàn)，該單寧酶在50 ℃熱處理1 h，其剩余酶活力基本未發(fā)生改變；60 ℃處理60 min，相對酶活力在80%以上；當(dāng)該酶在70 ℃處理30 min，能夠保持80%的酶活力，且在處理60 min后，依然能夠維持大約50%的酶活力，以上結(jié)果充分表明HBHF5菌株所產(chǎn)單寧酶具有極好的熱穩(wěn)定性（圖4C），該性能能夠保證該單寧酶在生產(chǎn)及貯存過程中保持較強活力，有利于酶制劑產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定。

在低離子濃度（1 mmol/L）存在的條件下，除 K＋、Li＋和Na＋未對酶活力造成抑制之外，金屬離子Cu2＋對酶活力抑制最為明顯，其次是Zn2＋對酶活性的抑制明顯（94%），其他活性抑制率結(jié)果為：Fe3＋（69%），Mn2＋（61%）和Mg2＋（22%）。以上的金屬離子在高離子濃度（5 mmol/L）下，對酶的抑制率不同程度增高，其中以Fe3＋和Na＋變化最為顯著，其抑制率分別為88%和31%（圖4D）。

圖4 A. fumigatus HBHF5的單寧酶酶學(xué)性質(zhì)分析Fig. 4 Characterization of tannase from strain HBHF5

2.4 菌株CAZymes基因表達(dá)分析

圖5 A. fumigatus HBHF5碳水化合物活性酶基因表達(dá)分析Fig. 5 Distribution of CAZymes gene expression in A. fumigatus HBHF5

通過對菌株HBHF5的轉(zhuǎn)錄組測序分析，共獲得該菌的23 927 186 條reads，數(shù)據(jù)量為3 589 077 900 bp，GC含量為53.41%，Q20值為98.12%，Q30值為95.10%，Percentage值為92.73%。通過對比對到參照基因組（Aspergillus fumigatus.CADRE.33）上的reads分布統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，reads分布在Exon區(qū)域值最高為87.98%，其次是定位在Integenic區(qū)域（11.8%），只有0.22%的reads定位在Intron區(qū)域，以上數(shù)據(jù)說明測序結(jié)果符合要求，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

菌株所產(chǎn)酶的種類決定著其在酶制劑開發(fā)中的潛力的大小，經(jīng)對A. fumigatus HBHF5的轉(zhuǎn)錄組分析，當(dāng)該菌以麩皮作為唯一碳源時，共有2 151 個酶基因表達(dá)，其中氧化還原酶579 個、轉(zhuǎn)移酶644 個、水解酶522 個、裂合酶167 個、異構(gòu)酶71 個和合成酶168 個，水解酶類數(shù)量大約占總酶的24%左右。

CAZymes是一類具有降解、修飾及生成糖苷鍵的功能酶類的總稱，由糖酯酶類（carbohydrate esterase，CEs）、糖苷水解酶類（glycoside hydrolase，GHs）、糖基轉(zhuǎn)移酶類（glycosyl transferase，GTs）和多糖裂解酶類（polysaccharide lyase，PLs）組成[18]。以麩皮為碳源時，菌株HBHF5中CAZymes基因表達(dá)結(jié)果如圖5所示。經(jīng)分析，CEs有12 個基因表達(dá)，GHs共有56 個基因表達(dá)，PLs共有2個基因表達(dá)，其中GHs表達(dá)最為豐富，約占CAZymes酶類表達(dá)總數(shù)的70%（167 個基因），約占總GHs家族的14.5%（21種），其主要種類如下：聚半乳糖醛酸酶、幾丁質(zhì)酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、海藻糖酶等。

以上結(jié)果表明，菌株A. fumigatus HBHF5酶系較豐富，是1 株優(yōu)良的產(chǎn)酶菌株。

3 討 論

大曲中的微生物種類豐富，是一類亟待挖掘的我國特有微生物資源[19]。到目前為止，已從大曲中獲得了產(chǎn)嗜熱淀粉酶和半乳糖苷酶的芽孢桿菌[20]，產(chǎn)糖化酶的棒曲霉和黑曲霉[21-22]及產(chǎn)酯酶的少根根霉等[23]，而從大曲中獲得產(chǎn)單寧酶的嗜熱真菌鮮有報道。Penicillium sp.、Aspergillus sp.、Polyporus sp.和Trametes sp.等屬均篩選獲得了產(chǎn)單寧酶的真菌[24]，而Aspergillus sp.來源的微生物是最具有商業(yè)開發(fā)價值的單寧酶生產(chǎn)菌種屬。本課題組前期從濃香大曲中篩選獲得了1 株產(chǎn)單寧酶的嗜熱真菌，經(jīng)鑒定該菌屬于煙曲霉種，命名為A. fumigatus HBHF5，該菌株在高溫培養(yǎng)時生長良好。

大多數(shù)單寧酶最適反應(yīng)溫度范圍在30～40 ℃之間，如A. niger N5-5單寧酶的最適溫度為45 ℃[25]，而A. fumigatus HBHF5所產(chǎn)單寧酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃左右，在70 ℃時依然具有50%以上的酶活力，屬于嗜熱酶，且該酶在50 ℃條件下酶活性穩(wěn)定，這有利于該酶制劑的貯存加工。通過9 種金屬離子對單寧酶活力的影響研究結(jié)果，幾乎未發(fā)現(xiàn)有激活酶活性的金屬離子，有6 種金屬離子對該酶的活性有不同程度的抑制，這與Rajakumar等[26]的研究結(jié)果相似，卻與Sena等[27]的研究存在一定的差異，這可能是由于不同來源的單寧酶性質(zhì)存在一定的差異所致。

目前，生產(chǎn)所用菌株（黑曲霉）在液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶時主要以胞內(nèi)單寧酶形式存在，這使得在提取單寧酶時，往往需要破壁處理，該操作不僅增加了生產(chǎn)成本，同時還使得在破壁處理時大量細(xì)胞內(nèi)蛋白溢出，加劇了單寧酶的分離純化難度[28]，因此，獲得在液體培養(yǎng)生產(chǎn)胞外單寧酶的菌株，具有極其重要的現(xiàn)實意義。研究發(fā)現(xiàn)，A. fumigatus HBHF5在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)時，所產(chǎn)單寧酶主要以胞外酶的形式存在，這對于單寧酶的生產(chǎn)極具經(jīng)濟效應(yīng)。固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵體系在含水量、含氧量、基質(zhì)濃度及能量傳遞等方面存在較大差異。到目前為止，影響其胞外分泌機制仍不清楚，需進(jìn)行進(jìn)一步探究。

食品酶類主要被用在碳水化合物原料的加工處理，因此分析菌株CAZymes的豐富程度，直接影響到菌株在食品酶制研發(fā)中的潛力。研究常通過對菌株不同酶活性的檢測來探究其產(chǎn)酶譜，雖然該策略具有一定的效果，但是酶種類數(shù)量往往較少，一般只有數(shù)種，因此不能客觀的對菌株的產(chǎn)酶潛力進(jìn)行評價[29]。隨著組學(xué)時代的到來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的成熟和成本的降低為開展產(chǎn)酶譜的研究提供了有利的支撐[30]。A. fumigatus HBHF5在麩皮誘導(dǎo)時，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析，共有2 151 個酶基因表達(dá)，有239 個CAZymes類基因表達(dá)，涉及到淀粉降解相關(guān)酶，纖維素降解相關(guān)酶和半纖維素降解相關(guān)酶，其酶總量遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的酶譜檢測數(shù)量。因此，利用組學(xué)技術(shù)能夠客觀真實的評價菌株產(chǎn)酶譜。綜上所述，A. fumigatus HBHF5是1 株具有巨大開發(fā)潛力的酶制劑生產(chǎn)菌株。