冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液對(duì)大鼠肝臟保存效果的研究

趙鵬偉 ，黃建釗 ，李瑋 ，劉雋 ，張佳偉 ，柳嚴(yán) ，劉江偉

1.貴州省人民醫(yī)院肝膽外科，貴州貴陽(yáng) 550002；2.貴州省貴陽(yáng)市貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550002

臨床上以肝臟移植最為常見(jiàn)，且肝臟移植的成功率呈逐年增加的趨勢(shì)，延長(zhǎng)了肝病患者的壽命[1]。對(duì)于肝臟移植最為關(guān)鍵的一步就是如何更好的保存、獲取高質(zhì)量的移植器官，一般來(lái)說(shuō)，如果常溫下對(duì)肝器官不實(shí)施任何針對(duì)性保護(hù)，短期內(nèi)會(huì)導(dǎo)致其功能降低或壞死，為了解決這一難題，器官保存液越來(lái)越多的被應(yīng)用到器官移植中，使離體器官在離體環(huán)境中也能保持較好的完整性和活性，提高了器官移植的成功率，促進(jìn)了器官移植的發(fā)展，但不同的器官保存液的保存效果和應(yīng)用價(jià)值也是不同的，如何選取保存液使器官的保存效果達(dá)到最優(yōu)，仍需要不斷的研究[2]。該文以2016年3月—2017年3月該院進(jìn)行肝臟移植試驗(yàn)的86只SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分析研究冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液對(duì)大鼠肝臟保存效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取該院進(jìn)行肝臟移植試驗(yàn)的86只SD大鼠作為該次研究對(duì)象，隨機(jī)數(shù)字表達(dá)法分為43例研究組和43例對(duì)照組。其中，對(duì)照組中雄性大鼠26只，雌性大鼠 17 只，體重為 240～289 g，平均體重為（264.2±0.3）g；研究組中雄性大鼠23只，雌性大鼠20只，體重為 245～300 g，平均體重為（272.3±0.2）g。 兩組大鼠均已達(dá)到健康和清潔標(biāo)準(zhǔn)，且在體重、周齡等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照組制作方法 對(duì)照組中采用UW保存液對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行保存。并構(gòu)建SD大鼠非循環(huán)離體灌注模型[3]。具體制作如下：對(duì)于需要移植的供體和受體，手術(shù)前8 h禁食不禁水，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉后在大鼠背部加墊，使其呈仰臥位，在大鼠腹部正中位置行十字切口，開(kāi)腹，用血管鉗固定腹腔，切斷并清除掉肝臟周?chē)┞冻龅难?，結(jié)扎左隔下靜脈，并將二者離斷；按壓腸管，使其向大鼠左下腹傾斜，分離并切斷肝臟周?chē)捻g帶，然后結(jié)扎血管，將手術(shù)刀順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，注意避免肝臟周?chē)M織受損，使肝臟充分游離，同時(shí)游離肝上肝下腔靜脈、門(mén)靜脈和膽總管等。從肝下下腔靜脈注入2 mL肝素鈉液 (肝素鈉125 μ/mL)使SD大鼠全身肝素化[4]。在距離肝門(mén)1cm的位置切開(kāi)膽管前壁，用插入硬膜外導(dǎo)管的方式固定膽管；從門(mén)靜脈置管原位灌注冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液和4℃的UW液，以3 mL/min的流速經(jīng)肝臟原位灌注30 min，阻斷肝上肝下腔靜脈，為開(kāi)辟一輸出道使灌出液輸出，在肝下下腔靜脈前壁切開(kāi)一小口，等到肝臟完全變?yōu)橥咙S色，切斷各血管并結(jié)扎肝上下靜脈，再將肝臟取出，放入保存液中保存，設(shè)定保存液保存溫度為4℃。兩組實(shí)驗(yàn)在保存結(jié)束后經(jīng)門(mén)靜脈留置管以8 mL/min的灌注量再灌注恒溫37℃的乳酸鈉林溶液30 min。離體結(jié)束后，檢測(cè)兩組大鼠的膽汁分泌量以及保存液的pH值和滲透壓，觀察兩組保存液的保存效果以及移植后器官的存活率。

1.2.2 研究組制作方法 研究組中采用冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行保存，具體制作過(guò)程如下：①取得100 g丹參，加入8倍量的水，在浸泡2.5 h后煎煮1.5 h，過(guò)濾渣后重復(fù)以上操作2次，每次1 h，濾過(guò)合并濾液，濾液濃縮后至1 L，備用。②首先將8 g新鮮秘制的蟲(chóng)草干粉樣品倒入蒸餾水中，在30℃的恒溫條件下浸泡3 h，12 000 r/min離心15 min，得到液體A，把剩下的藥渣放入250 mL的玻璃容器中，再加入150 mL的蒸餾水并在56℃的水浴中進(jìn)行4 h的回流，經(jīng)冷卻并采用簡(jiǎn)單的過(guò)濾，除去藥渣后經(jīng)0.45 μm混合纖維素酯膜濾器過(guò)濾除菌得到液體B?；旌蟽煞N液體配置成250 mL冬蟲(chóng)夏草液[5]。制成后，按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)器官保存液準(zhǔn)則在干燥清潔的條件下配置冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液，并于在室溫為20～24℃按1 000 mL的量配置。制作大鼠離體灌注模模型同上。

1.3 觀察標(biāo)準(zhǔn)

測(cè)定兩組保存液的膠體滲透壓和pH值；對(duì)大鼠進(jìn)行立體灌注后，通過(guò)膽管置管采集各肝臟標(biāo)本再灌注30 min內(nèi)分泌的膽汁，用手動(dòng)分液器測(cè)量分泌的膽汁量，并做好相關(guān)記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究組與對(duì)照組中的兩種保存液其pH值和滲透壓值相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩種保存液的pH值和滲透壓值對(duì)比（±s）

表1 兩種保存液的pH值和滲透壓值對(duì)比（±s）

m o l/L）1 0.9 5 1 1.0 3 1 5

研究組中的離體大鼠隨著時(shí)間的延長(zhǎng)所分泌的膽汁量越少，且膽汁的分泌量明顯少于對(duì)照組中的大鼠（P＜0.05）。 見(jiàn)表 2。

表2 兩組離體SD大鼠肝臟保存不同時(shí)間后再灌注膽汁分泌量[（±s），μL]

表2 兩組離體SD大鼠肝臟保存不同時(shí)間后再灌注膽汁分泌量[（±s），μL]

組別4 h 8 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h對(duì)照組（n=4 3）研究組（n=4 3）t值P值1.6 7±0.0 3 1.9 7±0.1 2 1 3.2 9 4＜0.0 5 2.3 4±0.2 1 2.2 3±0.1 3 1 3.3 9 1＜0.0 5 2.7 5±0.1 1 2.6 7±0.2 1 1 5.1 2 5＜0.0 5 3.0 1±0.0 4 2.8 6±0.0 9 1 7.9 3 5＜0.0 5 3.2 8±0.5 6 3.1 7±0.0 9 1 5.6 9 3＜0.0 5

3 討論

器官保存液的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了臨床醫(yī)學(xué)器官移植手術(shù)的發(fā)展和推廣，UW液是目前國(guó)內(nèi)比較常用的器官保存液，保存時(shí)間較長(zhǎng)，且大大提高了離體器官的質(zhì)量，為器官的移植和移植后的成功率做出了很大的貢獻(xiàn)[6]。該文充分利用中藥資源，根據(jù)冬蟲(chóng)夏草和丹參的藥理性質(zhì)，配置成冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液，以健康的SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)比分析了冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液和UW液對(duì)大鼠肝臟的保存效果，監(jiān)測(cè)兩種保存液的PH值和滲透壓以及兩組大鼠所分泌的膽汁量，從而得出相應(yīng)的結(jié)論[7]。

該次研究中所有的離體活體實(shí)驗(yàn)都在保存液配置成功后一周內(nèi)進(jìn)行，研究表明應(yīng)用冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液經(jīng)過(guò)一周的監(jiān)測(cè)后其指標(biāo)與UW液并無(wú)明顯差異，有一定的緩沖能力，有效防止酸中毒：雖然肝臟在離體后會(huì)流失一定的血量，但是其細(xì)胞內(nèi)的代謝并未停止，許多代謝產(chǎn)物的累積使氫離子的濃度升高，從而保存液的pH值會(huì)發(fā)生變化，臨床器官移植上保存液pH值與器官細(xì)胞pH值密切相關(guān)，保存液pH值的變化能進(jìn)一步反映出肝細(xì)胞pH值的變化。通常來(lái)說(shuō)，使肝細(xì)胞能發(fā)揮較好的功能，必須要將肝細(xì)胞的pH值穩(wěn)定在7.5左右，因此保持器官保存液的緩沖能力對(duì)防止酸中毒起到非常重要的作用[8]。結(jié)果顯示，所配置的冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液與UW液相比pH值無(wú)顯著差異，研究組中保存液的pH值和滲透壓分別為（7.41±0.56）和（325.09±11.03）mmol/L，與對(duì)照組中UW保存液的pH值和滲透壓相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了其具有強(qiáng)大的緩沖能力，能有效防止酸中毒，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組大鼠肝臟器官膽汁分泌量逐漸減少，且短期內(nèi)研究組膽汁分泌量與較相同時(shí)期的對(duì)照組相比，分泌量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，研究組膽汁分泌量比對(duì)照組研究組膽汁分泌量要更少一些，進(jìn)一步說(shuō)明冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液對(duì)肝臟器官的保護(hù)作用更好一些，有效防止組織壞死[10]。張佳偉等人[9]采用大鼠模型(IPRL)，加入不同劑量冬蟲(chóng)夏草，記錄膽汁流出量，結(jié)果提示冬蟲(chóng)夏草組的膽汁分泌(172.95±12.7)μL 明顯高于對(duì)照組(98.68±5.5)μL(P＜O.01)，門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)(38.87±12.66)U/L明顯低于保存對(duì)照組 (145.I2±8I.56)U/L[9]。

有個(gè)別研究中去掉了UW液中的青霉素、胰島素等成分后無(wú)明顯影響，該次研究中研制的新型保存液改用色氨酸，最終能生成ATP，為缺血細(xì)胞再灌注能量，防止了細(xì)胞再灌注遭受損傷，促進(jìn)了細(xì)胞的新陳代謝。此外，該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)所建立的SD大鼠非循環(huán)離體灌注模型便于觀察，簡(jiǎn)單且容易操作，有利于實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行[10]。為保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不受損壞，冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液中應(yīng)用高鎂抑制細(xì)胞內(nèi)的鈣超載,防止器官缺血損傷,利于促進(jìn)器官功能的恢復(fù)。加入冬蟲(chóng)夏草和丹參能起到拮抗氧自由基、抗氧化、和缺血再灌注損傷的作用，二者相結(jié)合有利于促進(jìn)對(duì)細(xì)胞膜的完整性保護(hù)[11]。此外，該次實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，應(yīng)檢查靜脈切口是否過(guò)大，是否與靜脈套管接口吻合；實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)大鼠體重予以麻醉劑量；取出肝臟時(shí)注意防止出血；注意對(duì)大鼠的保暖等[12]。

綜上所述，就對(duì)離體SD大鼠肝臟的保存效果來(lái)看，研制的冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液與UW液保存效果相近，在灌注后肝細(xì)胞膽汁分泌方面略?xún)?yōu)于UW液，冬蟲(chóng)夏草聯(lián)合丹參器官保存液對(duì)SD大鼠肝臟的保存效果較好，在臨床上值得進(jìn)一步推廣。