反相高效液相色譜法測定穿龍骨刺片中薯蕷皂苷的含量

喻貴英 劉偉霞 羅偉 洪贇 汪楊

（太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司 重慶 401336）

穿龍骨刺片具有補腎、健骨、活血、止痛的功效。主要用于骨質增生，骨刺疼痛的治療。該產品收載于《中國藥典》2015年版一部，由穿山龍、淫羊藿、狗脊、川牛膝、熟地黃和枸杞子等6味藥物組成。穿山龍為方中主藥，具有祛風除濕，活血通絡的功效，臨床用于治療類風濕關節(jié)炎。而薯蕷皂苷為穿山龍藥材的主要指標成份。在《中國藥典》2015年版一部穿龍骨刺片質量標準中采用高效液相色譜法測定穿山龍的水解產物薯蕷皂苷元的含量來控制產品質量，該方法中需要使用甲醇、三氯甲烷、乙腈，且用量較大，樣品前處理時間較長。為了減少有毒有害試劑的使用，縮短檢驗時間，保持與穿山龍藥材質量控制指標一致，便于制劑的質量控制，盡可能減少對人體及環(huán)境的影響，本文對穿龍骨刺片質量標準進行修訂。

1.實驗方法

1.1 儀器

安捷倫高效液相色譜儀HP-1260（自動進樣器G1329B、紫外檢測器G1315D），KQ-500DBB型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

穿龍骨刺片樣品由桐君閣藥廠提供，薯蕷皂苷（批號：111707-201402，含量以96.2%計）由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腈為色譜純，水為二次純化水（一級純化水），其余為分析純。

1.3 色譜條件

色譜柱為安捷倫Eclipse XDB-C18 250mm×4.6mm，5μm；流動相為乙腈：水（50:50）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測波長203nm；進樣體積：10μl 。

1.4 供試品溶液制備

取適量樣品，研細，取樣品0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，密塞，稱定重量，超聲（40kHz，500W）處理30min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.5 對照品溶液制備

精密稱取薯蕷皂苷對照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每ml含0.2mg的溶液，即得。

2.方法學考察

2.1 系統(tǒng)適應性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（50:50）為流動相；流速為1.0ml/min；檢測波長為203nm；柱溫：30℃。采用安捷倫C18（Eclipse XDB-C18 250mm×4.6mm，5μm）色譜柱測定，結果理論板數按薯蕷皂苷峰計算均不低于3800。

2.2 陰性對照實驗

為進一步考察試驗的合理性，取不含穿山龍的陰性對照樣品，依正文所述方法進行測定。結果陰性樣品色譜在與薯蕷皂苷峰相應的保留時間附近無干擾峰檢出，從而證明本方法是合理可行的。結果見下圖。

圖1 薯蕷皂苷對照圖

圖2 陰性對照圖

圖3 穿龍骨刺片樣品圖

2.3 標準曲線制備

精密稱取薯蕷皂苷對照品20.55mg（按96.2%計算含量），置25ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取貯備液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；再精密量取上述稀釋液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；依次操作，分別制成濃度為790.764μg/ml、395.382μg/ml、197.691μg/ml、98.846μg/ml、49.423μg/ml的對照品溶液，分別注入液相色譜儀，進樣體積10μl。以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，求出回歸方程為：Y=363.18X-4.3469（相關系數r=1.0）。進樣量在0.49423～7.90764μg范圍內，與峰面積呈良好的線性關系，符合外標法定量測定的要求。

2.4 精密度試驗

分別取濃度為790.764μg/ml、49.423μg/ml的對照品溶液，照正文方法，連續(xù)進樣6次，每次進樣10μl，記錄峰面積，高、低濃度的對照品峰面積RSD均為0.3%，結果表明精密度良好。

2.5 重復性試驗

取本品（批號16010001），照正文方法，獨立測定6份，平均值為2.9mg/片，RSD為0.6%，結果表明重復性較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品（批號14010001） 溶液，分別在0小時、4小時、12小時、24小時、48小時等不同時間點，精密吸取10μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，不同時間點峰面積的RSD為0.7%，結果表明樣品溶液在48小時內穩(wěn)定性較好。

2.7 回收率試驗

精密稱取已知含量的本品細粉約0.25g（批號：16010001，每克中含薯蕷皂苷5.96mg）6份做基底，分別精密加入薯蕷皂苷對照品溶液（濃度790.764μg/ml）2ml，照正文方法進行測定，計算回收率，平均回收率為100.9%，RSD為0.6%，結果表明回收率較好。

2.8 樣品測定結果

依照正文方法對10批留樣品進行了含量測定，每片含薯蕷皂苷在2.4mg至3.0mg之間?？紤]到藥材的批間差異、生產批次間的生產偏差、藥物之間的相互作用及藥物的穩(wěn)定性等影響因素，建議將穿龍骨刺片的含量限度制定為“每片含穿山龍以薯蕷皂苷計，每片不得少于2.0mg。

3.討論

3.1 在穿龍骨刺片原質量標準（《中國藥典》2015年版一部）中含量檢測指標為薯蕷皂苷元，是通過對樣品進行提取、酸水解、萃取而得的薯蕷皂苷元。從產品的工藝分析，在整個生產過程中，穿山龍藥材部分取粉，部分滲漉，不存在水解。采用原方法需使用甲醇、三氯甲烷、乙腈等試劑，且用量較大，對人體及環(huán)境都有一定的影響，檢驗時間長，檢驗成本高。且穿山龍藥材的質量控制指標也為薯蕷皂苷，為了便于原料與產品生產過程的質量控制，采用正文方法更適宜。

3.2 本實驗通過不同取樣量（0.25克、0.5克、0.7克、1.0克）、溶媒種類（70%甲醇、70 %乙醇， 50%乙醇）、超聲時間（30分鐘、45分鐘、60分鐘）、稀釋倍數等因素進行考察，最后確定樣品的制備選擇取0.5g樣品，加70%乙醇25ml超聲提取30min為宜， 該方法操作簡便易行。

3.3 本實驗中，比較了乙腈-水（55:45、50:50）兩種不同比例的流動相， 通過實驗發(fā)現乙腈-水（50:50）作為流動相較好，樣品分離度好，薯蕷皂苷保留時間適宜，陰性對照無干擾；并對目標色譜峰的純度進行了檢測，純度因子符合規(guī)定。

3.4 本實驗比較了安捷倫HP1200、HP1260和島津LC-20AT等3種型號的液相色譜儀，以及安捷倫、資生堂不同廠家的色譜柱，結果表明不同廠家的儀器、C18色譜柱對薯蕷皂苷含量無顯著性差異。