SR-B1信號(hào)通路介導(dǎo)銀杏葉提取物對內(nèi)皮細(xì)胞的抗血栓作用

何志軍 李媛彬

（湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校 湖南 株洲 412012）

動(dòng)脈粥樣硬化性疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，在發(fā)達(dá)國家被稱為“頭號(hào)殺手”。低密度脂蛋白（LDL）與動(dòng)脈粥樣硬化的多個(gè)發(fā)展過程有聯(lián)系。LDL在氧化應(yīng)激狀態(tài)下形成致動(dòng)脈粥樣硬化的oxLDL，oxLDL能引起內(nèi)皮功能紊亂及促進(jìn)血栓因子的分泌和血小板聚集，具有高度的致動(dòng)脈粥樣硬化的作用，動(dòng)脈粥樣損傷病灶中已發(fā)現(xiàn)有oxLDL的存在。而高密度脂蛋白通過恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞中被LDL等導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的脂質(zhì)削弱了的一氧化氮（NO）合成，間接地抑制了血小板的聚集。Valiyaveettil M[1]等認(rèn)為高密度脂蛋白對血小板活化的抑制作用取決于高密度脂蛋白中的載脂蛋白E，因?yàn)檩d脂蛋白E 能夠與血小板表面的SR-B1受體結(jié)合，激活血小板內(nèi)的內(nèi)皮型eNOS，從而誘導(dǎo)血小板合成NO，使血小板活化受到抑制。

國內(nèi)外的一些研究表明，從銀杏葉中提取的藥用有效成份主要為黃酮及銀杏內(nèi)脂等，簡稱銀杏葉提取物（GbE）[2]，具有明顯的抗氧化活性、抗自由基活性、改善微循環(huán)、降低血液粘度、降低Ca2+內(nèi)流、抑制血小板聚集等多種作用[2，3]，但具體抗血栓形成機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究GbE對oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞抗血栓功能改變及內(nèi)皮型eNOS的活化是否與SR-B1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路激活有關(guān)。

1.材料與方法

1.1 材料

HUVECs株原代培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均為Gibco/BRL產(chǎn)品；TXA2、P-選擇素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒（TRIzol）購于美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自大連寶生物有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；eNOS活性檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司；各種抑制劑均購自美國cell signaling公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購于美國Bio-Rad IQ5。

1.2 研究方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞匯集成單層達(dá)80%，0.01% 胰酶37℃消化5min，以1×105個(gè)接種于6孔板，貼壁24 h，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，然后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組處理。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測P-選擇素和TXA2含量

常規(guī)以消化法傳代培養(yǎng)細(xì)胞，將等量細(xì)胞懸液分別接種于24孔培養(yǎng)板上，調(diào)整細(xì)胞含量為5×105/孔，待細(xì)胞長成單層貼壁后，分組后取細(xì)胞培養(yǎng)液上清離心，再收集上清置于-20℃保存，然后按P-選擇素ELISA試劑盒說明操作，置于酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

總RNA提取：細(xì)胞分組處理，在6孔培養(yǎng)板中加入0.8mL Trizol核酸裂解液，按一步法提取細(xì)胞總RNA。用紫外分光法測A值進(jìn)行定量，并計(jì)算A260/A280值，提取的總RNA比值在1.7～2.0，表明所得總RNA完整。

RT-qPCR：（1）逆轉(zhuǎn)錄（RT）：用TaKaRa的PrimeScript RT regent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，分別加入總RN A、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進(jìn)行RT反應(yīng)。（2）實(shí)時(shí)定量PCR（q PCR）：加入PCR反應(yīng)體系、上下游引物、超凈水進(jìn)行PCR 反應(yīng)。SR-B1上游引物為5′-GGTCCAGAACATCAGCAGGATC-3′，下游引物為5′-GCCACATTTGCCCAGAAGTTCC-3′；eNOS上游引物為5′-GAAGGCGACAATCCTGTATGGC-3′，下游引物為5′-TGTTCGAGGGACACCACGTCAT-3′，反應(yīng)條件為：95℃，3min；95℃，10s；56℃，10s；72℃，30s，40個(gè)循環(huán)；65℃，30s；70℃，30s。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)獲取的循環(huán)閾值（ct值），釆用相對定量的方法計(jì)算2-△△ct分析數(shù)據(jù)作圖。目標(biāo)檢測的表達(dá)以內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.4 內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性測定

分組處理后收集各組內(nèi)皮細(xì)胞，加勻漿緩沖液后勻漿離心，制備內(nèi)皮細(xì)胞勻漿液。然后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行蛋白定量，用勻漿液緩沖液進(jìn)行樣品配平。加入eNOS反應(yīng)液置37℃水浴30min，煮沸5min終止反應(yīng)，離心后取上清液測定單位時(shí)間內(nèi)一氧化氮代謝產(chǎn)物（NOx）的產(chǎn)生量。NOx的測定采用高效液相色譜分析法（日本LC-2010AHT）。Macherey-Nag el離子柱（250mm×4.6mm，Nucleo sil100-5SB），紫外檢測器測定214nm處的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)品：亞硝酸鈉。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（one way-ANOVA），組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 GbE對oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞分泌P-選擇素、TXA2的影響

oxLDL（50μg/mL）刺激細(xì)胞24h后，與空白對照組比較，培養(yǎng)液中P-選擇素、TXA2水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GbE呈濃度依賴性抑制oxLDL對內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素、TXA2分泌的促進(jìn)作用，尤其以200mg/L更為顯著（P＜0.05）（表1）。提示GbE在oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能改變中具有重要作用。

表1 GbE對oxLDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞p-選擇素和TXA2水平的影響（±s，n=6）

表1 GbE對oxLDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞p-選擇素和TXA2水平的影響（±s，n=6）

與對照組比較：*P＜0.05；與oxLDL組比較：△P＜0.05。

Group mg/L p-select（ng/L） TXA2（ng/L）Control / 13.34±0.35 19.28±3.38 oxLDL / 256.46±5.89* 86.74±2.56*OxLDL+GbE 50 148.84±3.22* 53.71±3.42*100 89.96±3.39*△ 33.58±4.86△200 45.37±1.09△ 24.66±2.83△400 49.86±1.23 28.32±2.35

2.2 GbE對oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 活性的影響

從表2可見，與空白對照組相比，oxLDL（50μg/mL）降低內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 活性及NO的釋放，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與oxLDL組相比，GbE組在濃度為50、100、200μmol/L時(shí)，呈劑量依賴性的增加內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性及NO的釋放（P＜0.05）。當(dāng)GbE濃度超過200μmol/L 時(shí)，其作用持平。

表2 不同濃度的GbE對內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 活性的影響（±s，n=6）

表2 不同濃度的GbE對內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 活性的影響（±s，n=6）

與對照組比較：*P＜0.05；與oxLDL組比較：△P＜0.05。

Group mg/L NOx（pmol/50ul） eNOS activity percentage（%）Control / 161.32 ±23.13 100 oxLDL / 38.34±0.89* 23.6 OxLDL+GbE 50 64.24±5.78*△ 40.1 100 113.54±18.93△ 70.1 200 141.24±20.81△ 86.0 400 139.72±19.36 86.3

2.3 GbE對oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞SR-B1和eNOS的mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組相比，oxLDL（50μg/mL）降低SR-B1、eNOS mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與oxLDL組比較，GbE（200mg/L）可以抑制oxLDL對SR-B1、eNOS mRNA的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A、1B。

圖1 GbE對oxLDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞SR-B1和eNOS mRNA表達(dá)的影響（±s，n=4）與對照組比較：*P＜0.05；與oxLDL組比較：#P＜0.05。

2.4 SR-B1介導(dǎo)的信號(hào)分子對GbE增加內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 活性的影響

GbE（200mg/L）與oxLDL（50mg/L）共孵育組內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 活性較oxLDL組明顯增加（P＜0.05）；在加入GbE的同時(shí)加入SR-B1阻斷劑BLT4（100 μmol/L）、Akt強(qiáng)效抑制劑1L-6-hydroxy methyl-chiro-iositol-[（R）]-2-O-methyl-3-O-octadecylcarbonate（25μmol/L）以及PI3K強(qiáng)效特異性抑制劑AS-605240（80μmol/L）后，均能部分抑制GbE對內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 活性的增加（P＜0.05），見表3。

表3 SR-B1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子對GbE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 活性影響 （±s，n=6）

表3 SR-B1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子對GbE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 活性影響 （±s，n=6）

與對照組比較：*P＜0.05； 與oxLDL組比較：△P＜0.05；與oxLDL+GbE組比較：△△P＜0.05。

Group dose eNOS activity（pmol/50ul）Control / 161.32±23.15 oxLDL / 38.31±0.56*oxLDL+GbE 200mg/L 136.68±18.93△oxLDL+GbE+SR-B1（-） 100μmol/L 95.49±16.25 oxLDL+GbE+PI3K（-） 80μmol/L 100.65±15.96 oxLDL+GbE+Akt（-） 25μmol/L 91.87±10.72 oxLDL+GbE+SR-B1（-）+PI3K（-）+Akt（-）idem 56.36±3.88△△

3.討論

在動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病中，血栓形成大多是在內(nèi)皮細(xì)胞受損的基礎(chǔ)上發(fā)生的。內(nèi)皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激或其他致炎因子作用下可合成分泌大量的細(xì)胞因子，如TXA2/TXB2以及P-選擇素、E-選擇素等，參與凝血和血栓形成。因而，保護(hù)內(nèi)皮功能、促進(jìn)其抗栓功能為血栓性疾病防治的重要措施。

銀杏葉中的有效成分黃酮類化合物對冠心病、心絞痛的療效良好，與降低血脂、改善血液流變性，降低過氧化脂（LPO）、提高超氧化物歧化酶（SOD）活力、清除超氧陰離子自由基等自由基有關(guān)；它通過舒張冠狀動(dòng)脈、改善微循環(huán)、降低Ca2+內(nèi)流、抑制血小板聚集等作用，達(dá)到保護(hù)心、腦血管系統(tǒng)的目的。銀杏葉的另一種有效成分銀杏內(nèi)酯是迄今臨床上應(yīng)用最有價(jià)值的天然血小板活化因子（PAF）拮抗劑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明oxLDL可使內(nèi)皮細(xì)胞釋放TXA2以及P-選擇素增加。GbE可抑制oxLDL誘導(dǎo)的TXA2以及P-選擇素釋放，提示GbE對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血栓形成有重要的意義。

OxLDL不僅在氧化應(yīng)激致動(dòng)脈粥樣硬化過程中起主導(dǎo)作用，還可以通過改變內(nèi)皮細(xì)胞功能參與血栓形成，從而誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化及其所引發(fā)的急性冠脈綜合征。血管內(nèi)皮功能調(diào)控與NO和eNOS活性密切相關(guān)。NO具有松弛血管平滑肌、調(diào)節(jié)血管張力、調(diào)整局部血流、抑制血小板聚集粘附、介導(dǎo)細(xì)胞免疫吞噬等作用，在動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病等心血管代謝病的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。eNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO在心血管代謝病防治方面有重要作用。而高密度脂蛋白通過恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞中被LDL等導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的脂質(zhì)削弱了的NO合成，間接地抑制了血小板的聚集，以及通過載脂蛋白A-I與B 族Ⅰ型清道夫受體（SR-BI）的結(jié)合，高密度脂蛋白還可以活化eNOS，促進(jìn)一氧化氮合成[4]。本研究采用離體研究的方法，觀察暴露于oxLDL環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性的變化。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，升高培養(yǎng)基中oxLDL濃度可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性，內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生減少，同時(shí)加入GbE能減弱這種抑制作用，且呈劑量依賴性。而應(yīng)用信號(hào)分子抑制劑干預(yù)的研究發(fā)現(xiàn)，三種抑制劑均能不同程度地抑制GbE對eNOS活性的增加，進(jìn)一步證實(shí)了GbE經(jīng)高密度脂蛋白及其受體介導(dǎo)的血管內(nèi)皮保護(hù)作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路可能經(jīng)由PI3K和Akt所介導(dǎo)，提示對SR-B1依賴的PI3K/Akt/eNOS信號(hào)途徑的促進(jìn)作用可能是該藥及其有效組分抗血栓作用的主要環(huán)節(jié)。