雙效工程菌Y1溶藻產(chǎn)物的急性毒性與健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

潘瑞松 沈紅池 吳旭鵬 蔡慶慶 王明新 張文藝

摘 要：

為檢測(cè)溶藻、藻毒素降解雙效工程菌Y1溶藻產(chǎn)物的生物毒性，采用發(fā)光細(xì)菌測(cè)定急性毒性，利用USEPA推薦模型對(duì)水源水進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。結(jié)果表明，Y1溶藻菌液能有效地抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，并對(duì)發(fā)光細(xì)菌具有輕微的毒性。當(dāng)葉綠素a濃度為34.92 mg/m3時(shí)，增加投加量會(huì)使藻液毒性加強(qiáng)；當(dāng)葉綠素a濃度大于46.56 mg/m3時(shí)，加菌后藻液毒性明顯降低。水源水中MCLR的非致癌風(fēng)險(xiǎn)值為2.89～4.87，通過(guò)BAF處理后能減少到1.3，而加Y1菌強(qiáng)化后得到的0.6達(dá)到了健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估安全標(biāo)準(zhǔn)。UV254與致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型表明經(jīng)過(guò)處理的水中有機(jī)物無(wú)致突變性，說(shuō)明Y1應(yīng)用于水源水無(wú)生物毒性和致突變風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：發(fā)光細(xì)菌；葉綠素；藻毒素；急性毒性；健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

中圖分類號(hào)：X703

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：16744764（2018）05014106

收稿日期：20171115

基金項(xiàng)目：

國(guó)家自然科學(xué)基金（41571471），江蘇省及常州市科技支撐項(xiàng)目（BE2016653、WS201621、CE20175009）

作者簡(jiǎn)介：

潘瑞松（1968），高級(jí)工程師，主要從事飲用水安全保障研究，Email：326664395@qq.com。

張文藝（通信作者），男，博士、教授，Email：zwy@cczu.edu.cn。

Received：20171115

Foundation item：

National Natural Science Foundation of China（No.41571471），Jiangsu Province and Changzhou Science and Technology Support Project（No.BE2016653，WS201621，CE20175009）

Author brief：

Pan Ruisong（1968），senior engineer， main research interest： urban drinking water safety，Email：326664395@qq.com.

Zhang Wenyi（corresponding author）， PhD， professor，Email：zwy@cczu.edu.cn.

Acute toxicity of the algaelying products and assessment on health

risks of microcystin in drinking water sources

Pan Ruisong1，2，Shen Hongchi1， Wu Xupeng1， Cai Qingqing1，

Wang MingXin1， Zhang Wenyi1

（1.School of Environmental & Safety Engineering， Changzhou University， Changzhou 213164， Jiangsu， P. R. China；

2.Changzhou Environmental Protection Technology Exploitation and Development Center， Changzhou 213022， Jiangsu， P. R. China）

Abstract：

In order to detect the toxicity of algicidal products and valuate the harm of microcystin in the water source to the human body， the luminescent bacteria was to determine the toxicity， USEPA recommended model provided a health risk assessment of source water. The results show that the strain Y1 inhibit the growth of microcystis aeruginosa effectively. The strain had a slight toxicity to the luminescent bacteria. When the concentration of chlorophyll a was 34.92 mg/m3， the increase of dosage could enhance the toxicity of algae. The toxicity of liquid algae added bacteria was significantly lower than that of the control group， when the concentration of chlorophyll a was greater than 46.56 mg/m3. The non carcinogenic risked index of MCLR in the water source was 2.89～4.87， which was reduced to 1.3 after BAF treatment， even to 0.6 after adding strain Y1. It reached health risk assessment safety standards when the the value was less than 1. Through the prediction model， it was found that the organic matter in treated water had no mutagenicity， it indicated that waters with strain Y1 had not biotoxicity and mutagenicity.

Keywords：

luminescent bacteria；chlorophyll；microcystin；acute toxicity；health risk assessment

中國(guó)南方飲用水多取自于淡水湖泊、河流及水庫(kù)。隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化的加重，水源地藍(lán)藻爆發(fā)日益頻繁[12]。藍(lán)藻爆發(fā)不僅導(dǎo)致水質(zhì)下降，還會(huì)產(chǎn)生藻毒素，其中微囊藻毒素（Microcystins，MCs）具有極強(qiáng)的肝、腸致癌毒素，嚴(yán)重危害著人們的健康，所以保護(hù)水源水迫十分急迫[35]。生物法是近年來(lái)興起的、利用溶藻細(xì)菌控制水體藻類繁殖的一種控藻方法，其基本控藻機(jī)制一是通過(guò)直接與藻接觸殺藻，二是通過(guò)菌分泌的胞外物質(zhì)殺藻[67]。但對(duì)溶藻產(chǎn)物及藻溶解后生物殘留物的急性毒性、健康風(fēng)險(xiǎn)和致突變鮮有研究[8]。

發(fā)光細(xì)菌是一種在自然狀態(tài)下能夠發(fā)出熒光的細(xì)菌，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于水、土壤、沉積物等方面的毒性測(cè)定，是一種快捷、高效、廉價(jià)的毒性測(cè)試方法[911]。健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)是評(píng)價(jià)人體長(zhǎng)期攝入某種有害物質(zhì)后對(duì)人類造成的傷害[1214]。而為了確保居民飲用水安全，對(duì)含MC的水可能造成的危害進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)是十分必要的。健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)采用模型計(jì)算有毒物質(zhì)對(duì)人群的影響，美國(guó)（USEPA）推薦的模型是較為常用的評(píng)估模型[1516]。

將已構(gòu)建的溶藻和藻毒素雙效工程菌Y1制成菌劑，利用發(fā)光細(xì)菌研究其對(duì)銅綠微囊藻降解產(chǎn)物的毒性。采用美國(guó)環(huán)保署EPA推薦的健康風(fēng)險(xiǎn)模型——有機(jī)物致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型公式[15]對(duì)水源水、曝氣生物濾池（BAF）處理水和Y1菌劑強(qiáng)化處理水進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 菌劑培養(yǎng)基和菌種

1）菌種：采用本課題組專利“一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1及其構(gòu)建方法（專利201310419121.5）”中的菌劑Y1菌（Bacillus sphaericus，保藏號(hào)CGMCC NO.7519）。

2）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 15 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

1.2 銅綠微囊藻來(lái)源及培養(yǎng)

選用的藻種為銅綠微囊藻（M.aeruginosa）FACHB905，購(gòu)于中科院武漢水生生物研究所國(guó)家淡水藻種庫(kù)。將購(gòu)買的藻靜置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件：溫度28℃、光照強(qiáng)度2 500 lx、光照周期比12 h∶12 h。

1.3 菌劑Y1制備方法

用接種環(huán)取斜面培養(yǎng)基上的Y1菌置于高壓滅菌后的液體培養(yǎng)基內(nèi)在140 r·min-1的震蕩箱內(nèi)恒溫震蕩24 h。

1）菌液投加比對(duì)溶藻產(chǎn)物的急性毒性試驗(yàn) 將培養(yǎng)18 h的菌液分別以菌藻比1∶5，1∶10，1∶20的量投加，并于溫度28 ℃、光強(qiáng)2 500 lx、光暗周期12 h∶12 h條件下，在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，取樣測(cè)定葉綠素a的濃度和培養(yǎng)液急性毒性。

2）初始藻液質(zhì)量濃度的溶藻產(chǎn)物急性毒性試驗(yàn) 將培養(yǎng)18 h的菌液分別以菌藻比1∶10的量投加到不同初始濃度的新鮮藻液中，并于溫度28 ℃、光強(qiáng)2 500 lx、光暗周期12 h∶12 h條件下，在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，取樣測(cè)定葉綠素a的濃度和培養(yǎng)液急性毒性。

1.4 檢測(cè)方法

1）葉綠素a的測(cè)定：Chla測(cè)定[17]：參照國(guó)家環(huán)?？偩志幍摹端蛷U水監(jiān)測(cè)分析方法（第四版）》，其中的丙酮用乙醇代替。

2）發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)定：發(fā)光細(xì)菌遇到毒性物質(zhì)，發(fā)光會(huì)受到抑制。對(duì)照和樣品均設(shè)兩個(gè)平行管，將管子按照順序排布，凍干菌劑用稀釋液活化15 min后，加100 μL到每個(gè)試管中，過(guò)15 min后測(cè)空白。以NaCl稀釋液作為對(duì)照，2 000 μL待測(cè)樣品加入200 μL調(diào)解液混勻，兩個(gè)平行管每管900 μL，過(guò)15 min后測(cè)發(fā)光亮。

cF=b/a

e%=c×cF-d/c×cF×100%

相對(duì)發(fā)光度%=1-e

式中：a為對(duì)照組的空白；b為對(duì)照組測(cè)定數(shù)據(jù)；cF為對(duì)照組的相對(duì)剩余發(fā)光度；c為樣品組的空白；d為樣品組測(cè)定數(shù)據(jù)；e為光損。

1.5 BAF處理水源水健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法

國(guó)際癌癥研究署（IARC）將化學(xué)物的分類為Ⅰ級(jí)（致癌）、ⅡA級(jí)（很可能致癌）、ⅡB級(jí)（可能致癌）、Ⅲ級(jí)（無(wú)法歸類）和Ⅳ級(jí)（很可能不致癌）。MCLR屬于ⅡB級(jí)，對(duì)人類致癌性證據(jù)有限[18]。非致癌風(fēng)險(xiǎn)值計(jì)算公式為[19]

R=CDIRfD（1）

式中：RfD為MCLR進(jìn)入人體的參考劑量（mg/kg·d）。目前尚無(wú)MCLR的RfD的值，國(guó)際上通用0.04 μg/（kg·d）作為其值；CDI為長(zhǎng)期通過(guò)飲用水方式每日每千克體重下的攝入量mg/（kg·d）。

在飲水途徑暴露下，CDI的計(jì)算公式為

CDI=C×IR×EF×EDBW×AT （2）

式中：C為水源水中MCLR所存在的濃度，mg/L；IR為成人飲水率，USEPA建議值為2 L/d；EF為暴露于致癌物質(zhì)的頻率，即接觸含MCLR水的頻率，定該值為365 d/a；ED為接觸MCLR總共所持續(xù)的時(shí)間，USEPA推薦的數(shù)值為30 a；BW為攝入MCLR的人體體重，通過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為60 kg；AT為接觸引用水的時(shí)間，對(duì)于非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)該值為ED×365 d/a[20]。

1.6 有機(jī)物致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型

研究表明水質(zhì)參數(shù)如氮磷、COD、pH和 UV254等數(shù)值與致突變強(qiáng)度有密切聯(lián)系。學(xué)者們就水質(zhì)參數(shù)與致突變強(qiáng)度（Mutation Rate，MR）建立了多種模型[21]。建立水質(zhì)參數(shù)與致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型能為水環(huán)境監(jiān)測(cè)部門提供檢測(cè)水質(zhì)毒性強(qiáng)度的便捷方法。有關(guān)于UV254與致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型，在此模型中以UV254數(shù)值作為自變量，以定量水樣致突變強(qiáng)度為因變量。多項(xiàng)研究揭示了UV254和溫度與水質(zhì)有機(jī)物致突變強(qiáng)度有較高的相關(guān)性。本研究采用多元回歸方程

MR=12.749×UV254+0.054×temp+0.312，引入U(xiǎn)V254和溫度2個(gè)指標(biāo)[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌液投加比例對(duì)溶藻產(chǎn)物的急性毒性

將初始葉綠素a濃度34.92 mg/m3的藻液加入不同菌量于28 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 d，測(cè)定空白樣和加菌樣的葉綠素a，發(fā)現(xiàn)加入菌劑Y1均能對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)生降解作用。隨著時(shí)間的增加降解率提高，在第6 d葉綠素a的量均為0。在此基礎(chǔ)上，研究不同菌藻比對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性研究，以未加菌液的銅綠微囊藻為對(duì)比，在第3 d時(shí)，空白、1∶10、1∶5的相對(duì)放光度都降低了，而菌藻比1∶20的相對(duì)發(fā)光度上升了，到了第6 d，各溶液的相對(duì)發(fā)光度繼續(xù)減少，投菌量越多，對(duì)發(fā)光細(xì)菌的抑制作用越強(qiáng)，藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)Y1菌的降解毒性反而增強(qiáng)了?？赡艿脑蚴窃辶枯^少導(dǎo)致菌大量繁殖，而Y1菌為球形芽孢桿菌，球形芽孢桿菌能夠作為殺蚊劑，具有一定的毒性[23]。

2.2 初始藻液質(zhì)量濃度對(duì)溶藻產(chǎn)物急性毒性影響

在初始葉綠素a濃度分別為34.92 mg/m3、46.56 mg/m3、58.2 mg/m3的藻液中投加1∶10的Y1菌液，由圖可知，Y1菌液對(duì)不同初始濃度的藻液均有降解效果。在第3 d分別降解至21.22 mg/m3、21.12 mg/m3、23.38 mg/m3，初始濃度高抑制效果更好，處理6 d后Y1菌均能將藻完全殺死。對(duì)于不同初始濃度的藻液進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌的毒性研究，從第1 d的數(shù)據(jù)可以看出，藻初始濃度越高對(duì)發(fā)光細(xì)菌的抑制能力越強(qiáng)。隨著未加菌樣葉綠素a濃度的提高，其相對(duì)發(fā)光度隨之降低，藻濃度越高，相對(duì)發(fā)光度越低。加入1∶10的Y1菌液后，濃度2和3的水樣相對(duì)發(fā)光度雖然降低，但與對(duì)照組相比，其對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性并沒(méi)有那么強(qiáng)。菌液作用6 d后，處理組的相對(duì)發(fā)光度分別為71.75%、77.10%、69.47%，而對(duì)照組為80.02%，66.63%，66.47%。說(shuō)明水樣中微量的藻毒性較小，而藻濃度較高時(shí)，水中的藻毒素的含量因藻的代謝和破裂比低濃度時(shí)更高[24]，Y1菌劑是溶藻和降解藻毒素的雙效工程菌，投加菌劑后既能溶解藻又將產(chǎn)生的藻毒素也降解了，能夠有效的降低水質(zhì)的急性毒性。

2.3 BAF進(jìn)出水源水健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

向其中一個(gè)BAF裝置中投加250 mL 1.87×105 cfu·mL-1的Y1菌液。以BAF裝置處理的進(jìn)出水樣中MCLR質(zhì)量濃度為基礎(chǔ)，運(yùn)用式（2）計(jì)算出MCLR的長(zhǎng)期攝入量并通過(guò)非致癌風(fēng)險(xiǎn)值計(jì)算式（1）計(jì)算出R值。通過(guò)BAF工藝處理過(guò)的水源水MCLR濃度都下降了。由測(cè)定的藻毒素含量可知未加菌的1號(hào)BAF進(jìn)水MCLR濃度在2.89～4.75 μg/L之間，而加菌的2號(hào)BAF進(jìn)水MCLR濃度在3.34～4.87 μg/L之間，1號(hào)出水濃度為156～3.33 μg/L，2號(hào)加菌處理后的濃度在0.72～3.37 μg/L。水樣中MCLR的R值為2.4 ～ 4.05，經(jīng)過(guò)處理之后水樣的毒性均減小了，1號(hào)BAF工藝出水R值最低1.3，最高2.8，而加菌以后對(duì)MCLR的去除效率更高，R值為0.6 ～ 2.8。

通常認(rèn)為R值>1對(duì)人的身體有害，R值≤1對(duì)人的身體危害較小[25]。通過(guò)上述計(jì)算可知處理前的水中MCLR的R值均>1，原水中MCLR含量超標(biāo)嚴(yán)重影響人體健康，經(jīng)過(guò)BAF處理后出水的R值明顯減小，但由于原水樣的MCLR濃度過(guò)高，處理后的水樣仍然損害人體，加菌處理的水樣處理效果比未加菌的樣好，處理完的水最低R值達(dá)到0.6，小于1，符合要求。

2.4 有機(jī)物致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型

從3月28日至4月29日中選取8 d測(cè)定水溫和Y1菌強(qiáng)化后BAF裝置的進(jìn)出水UV254數(shù)值。通過(guò)測(cè)得的數(shù)據(jù)可知，經(jīng)過(guò)處理后水的UV254遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于進(jìn)水值。UV254數(shù)值能夠很好的確定水中大分子有機(jī)物的量，這些大分子包括一些能致癌的芳香族化合物。通過(guò)回歸方程計(jì)算得到不同UV254下的回復(fù)突變率MR。通常認(rèn)為MR>2則有致突變性，而MR≤2即為無(wú)致突變性。未經(jīng)處理的源水MR在2.24 ～ 3.06之間，均大于2具有致突變性，而經(jīng)過(guò)處理后水的MR在0.46 ～ 0.85之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于2，基本清除致突變性。

3 結(jié)論

1）由于Y1菌為球形芽孢桿菌具有一定毒性，當(dāng)藻濃度過(guò)低時(shí)加入Y1菌劑的毒性要比不加菌高。而藻濃度越高，對(duì)發(fā)光細(xì)菌毒性越大，加菌后葉綠素a濃度降低，對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性也隨之降低，分析說(shuō)明溶藻產(chǎn)物對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性并不大。

2）健康分險(xiǎn)評(píng)價(jià)模型分析表明，未經(jīng)BAF處理過(guò)的水中MCLR的R值為2.4～4.05，對(duì)人體的傷害很大，處理過(guò)后的水R值明顯減少為1.3～2.8，加Y1菌的BAF出水MCLR的R值最低達(dá)到06，低于基準(zhǔn)值，無(wú)健康風(fēng)險(xiǎn)。UV254與致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型分析表明，處理前的水中有機(jī)物MR>2，具有致突變性，而經(jīng)過(guò)處理的水MR遠(yuǎn)小于2，基本無(wú)致突變性，說(shuō)明Y1應(yīng)用于水源水無(wú)生物毒性和致突變風(fēng)險(xiǎn)。

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（編輯 胡玲）