不同癌種患者外周血Survivin及其剪接變異體的表達研究

盧杰，鄧珊珊，姜世君，江榮科（.大慶醫(yī)學高等?？茖W校，黑龍江大慶633；.大慶龍南醫(yī)院，黑龍江大慶633）

早期發(fā)現(xiàn)癌癥，篩查非常重要，但傳統(tǒng)腫瘤標志物缺少所需靈敏度。據(jù)文獻報道，存活素（Survivin）主要分布于大多數(shù)常見腫瘤組織內(nèi)，在腫瘤的診斷中具有重要作用。Survivin蛋白有2種具有不同抗凋亡特性的新的Survivin剪接變異體，一種是缺乏外顯子3的Survivin-△EX3；一種是保留了部分內(nèi)含子2作為隱性外顯子的Survivin-2B。通過轉(zhuǎn)染實驗研究2種剪接變異體對凋亡的調(diào)控發(fā)現(xiàn)，Survivin-△EX3保留了抗凋亡特性，而Survivin-2B的抗凋亡能力明顯降低。Survivin可用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測，qRT-PCR采用獨特封閉反應，減少了污染，可靠性高，且操作時間短。本研究應用qRT-PCR檢測了肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌患者外周血Survivin及其剪接變異體——Survivin-△EX3、Survivin-2B mRNA表達量及檢出率，探討了作為腫瘤標志物的外周血Survivin及其剪接變異體診斷早期癌癥是否更為靈敏，旨在為進一步早期癌癥的篩查提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器 總RNA抽提試劑購自美國Invtrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA分子標準2000均購自寶生物工程（大連）有限公司，RNA抑制劑、6×上樣緩沖液均購自美國Fermentas公司，熒光核酸凝膠染料購自美國Biotium公司，超純水購自韓國BIONEER公司，qRTPCR 8聯(lián)管購自美國BIO-RAD公司，PCR引物由北京擎科生物工程有限公司合成，2720型PCR儀購自美國ABI公司，四通道qRT-PCR儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2013—2015年采集大慶龍南醫(yī)院新入院且未進行放、化療或手術(shù)治療的90例腫瘤患者靜脈血，以乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集抗凝血，其中乳腺癌患者22例，肺癌患者23例，結(jié)直腸癌患者23例，胃癌患者22例。另采集30例職工體檢者靜脈血作為對照組。90例腫瘤患者均經(jīng)病理類型組織細胞學、影像學、臨床表現(xiàn)等確診。

1.2.2 引物設(shè)計 應用Primer premier5.0軟件設(shè)計并合成特異性引物。見表1。

表1 引物設(shè)計

1.2.3 RNA提取 采用通用型RNA快速提取試劑盒，提取樣品RNA，最后加入30.00μL無RNase的水，溶解RNA。

1.2.4 DNase I消化樣品RNA中DNA 10μg RNA模板、4.00μL核糖核酸酶抑制劑、10.00μL脫氧核糖核酸酶Ⅰ緩沖液、10.00μL脫氧核糖核酸酶Ⅰ、焦碳酸二乙酯處理水至 100.00μL，混勻37℃90 min。取各個RNA樣品4.00μL，瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。

1.2.5 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的具體操作：3μg RNA 模板、4.00μL引物（50μmol/L）、焦碳酸二乙酯處理水至25.00μL，混勻70℃5 min，立即冰浴。8.00μL 6×上樣緩沖液、4.00μL脫氧核糖核苷三磷酸 10 mmol/L、1.00 μL RNase Inhibitor，混勻 37 ℃5 min，加入2.00μL反轉(zhuǎn)錄酶，42℃保溫60 min，于70℃溫育10 min，結(jié)束反應，置冰上保存，以備PCR實驗。

1.2.6 PCR檢測 取0.2 mL薄壁PCR管，分別編號。向各管中加入含染料2×PCR擴增預混和溶液10.00μL，10 mol/L各基因引物混合物1.00μL，對應的cDNA各2.00μL，其中1管不加模板作為陰性對照，各管補加水至20.00μL，混勻后置于PCR儀中95℃預變性5 min，95℃15 s→65℃30 s，40個循環(huán)；120 V電壓下電泳20 min，電泳結(jié)束后采用凝膠紫外分析儀照相保存。

1.2.7 qRT-PCR實驗 取0.2 mL薄壁PCR管，分別編號，加入1.00μL cDNA模板、0.50μL 10 mmol/L引物、12.50μL 2×PCR擴增預混和溶液、1.25μL實時定量PCR DNA結(jié)合染料，用雙蒸水補至25.00μL，混勻，置于qRT-PCR儀中。95℃預變性5 min后，95℃15 s→65℃30 s（熒光檢測），40個循環(huán)。溶解曲線65～95℃。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗、LSD-t檢驗等；正態(tài)分布資料采用直條圖描述，非正態(tài)分布資料采用箱式圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA提取結(jié)果 各組研究對象提取的總RNA經(jīng)核酸蛋白測定儀測定為6.8～22.7μg/mL，A260/A280比值為1.8～2.1，說明提取的RNA濃度適當，純度高。RNA提取物于1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，結(jié)果每條泳道對應都有3條亮帶，從上至下依次為28、18、5 S，說明RNA產(chǎn)物完整性較好。不同癌種RNA電泳圖見圖1。

圖1 不同癌種RNA電泳圖

2.2 PCR擴增結(jié)果 以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板擴增目的片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大小與目的片段一致，條帶清晰，無引物二聚體，能滿足后續(xù)實驗的要求。PCR擴增產(chǎn)物電泳圖見圖2。

圖2 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.3 qRT-PCR結(jié)果

2.3.1 擴增曲線及溶解曲線 擴增曲線基線平直，各管平行性良好，擴增效率相近。溶解曲線峰值較高，尖峰，且無雜峰，表明擴增產(chǎn)物特異性高，擴增體系良好。見圖3。

2.3.2 各組研究對象 Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3相對表達量比較 與對照組比較，肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌Survivin mRNA、Survivin-△Ex3 mRNA相對表達量均明顯升高，Survivin-2B mRNA相對表達量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2、圖 4～6。

圖3 擴增曲線和溶解曲線

表2 各組研究對象Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3相對表達量比較（±s）

表2 各組研究對象Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05

檢測項目Survivin Survivin-2B Survivin-△Ex3胃癌（n=22）1.850±0.402a 0.061±0.052a 0.911±0.110a對照組（n=30）0.025±0.007 0.840±0.141 0.026±0.005肺癌（n=23）1.771±0.140a 0.139±0.040a 1.478±0.202a乳腺癌（n=22）1.551±0.071a 0.201±0.041a 1.771±0.091a結(jié)直腸癌（n=23）1.849±0.611a 0.072±0.048a 1.331±0.051a

2.3.3 不同癌種患者外周血 Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3檢出率比較 不同癌種患者外周血Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3 檢出率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖4 各組研究對象Survivin相對表達量比較

圖5 各組研究對象Survivin-2B相對表達量比較

圖6 各組研究對象Survivin-△Ex3相對表達量比較

表3 不同癌種患者外周血Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3檢出率比較[n（%）]

3 討 論

腫瘤是一種多基因疾病，目前，已發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)基因達500種以上，腫瘤病因的復雜性和多樣性決定了腫瘤研究工作的艱巨性。腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是降低死亡率，改善患者預后的關(guān)鍵所在。

腫瘤標志物是由腫瘤細胞本身所產(chǎn)生的或由機體對腫瘤細胞反應而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)[1]。外周血腫瘤標志物的檢測具有無創(chuàng)傷、可重復、可于同一時間點進行多項指標檢測等優(yōu)點，是腫瘤診斷和隨訪的理想手段[2]。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的最新成員，是1997年耶魯大學GARZON等[3]利用效應細胞蛋白酶受體-1 cDNA在人類基因組庫中篩選分離出來的，因其具有強大的抗細胞凋亡功能，故被命名為“存活素或生存素”。

Survivin基因全長14.7 kb，是迄今發(fā)現(xiàn)作用最強的凋亡抑制蛋白之一，有研究探討了Survivin在體外培養(yǎng)細胞中的表達，結(jié)果顯示，60種人類腫瘤細胞株均有Survivin的表達，包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤等，其是人腫瘤細胞和正常組織細胞中表達有差異的蛋白質(zhì)之一，這一特點可能使其成為腫瘤標志物之一[4]。由于Survivin在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，其也可能成為腫瘤基因診治的理想靶點[5]。

魏霞等[6]采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測了活檢組織Survivin mRNA的表達，46例肺癌組患者Survivin mRNA表達明顯高于17例肺部良性疾病組。一項非小細胞肺癌的研究表明，患者體內(nèi)Survivn表達率達85.0%[7]。Survivin基因可能為肺癌的診斷提供了新的方法[8]。王彬等[9]采集50例接受手術(shù)的胃癌患者癌變組織，通過RT-PCR檢測Survivin mRNA的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者Survivin mRNA表達陽性率高達68.0%，提示Survivin或許可以作為胃癌早期診斷的重要分子標志物。王波[10]采集50例胃癌患者、20例胃良性病變患者及35例健康者外周血，采用RT-PCR檢測Survivn mRNA的表達，結(jié)果顯示，胃癌患者外周血Survivn mRNA表達量明顯高于健康者及胃良性病變患者。李昌榮等[11]認為，采用實時定量RT-PCR檢測外周血Survivin基因表達，可能是一種較理想的無創(chuàng)性早期診斷、評估胃癌患者預后的有效指標，有助于延長胃癌患者生存時間及改善其生活質(zhì)量。有研究表明，肝細胞癌組織Survivin mRNA表達量明顯高于其相應的癌旁組織及正常肝臟組織[12]。施朕善等[13]研究了116例結(jié)直腸癌患者，Survivin mRNA表達陽性率為76.7%。邢春瑤等[14]在42例宮頸癌患者的病變組織中檢測出Survivin表達陽性率為100.0%，在乳腺癌中Survivin表達陽性率為70.0%。JHA等[15]通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，高達93.6%的乳腺癌患者Survivin高表達。張香連[16]研究表明，Survivin在乳腺癌患者外周血中表達水平明顯高于乳腺良性腫瘤患者和健康婦女，提示Survivin是診斷乳腺癌的良好腫瘤標志物。

目前已發(fā)現(xiàn)，人Survivin通過不同的選擇性剪接形成5種剪接變異體，編碼5種不同的蛋白質(zhì)，分別為Survivin、Survivin-2B、Survivin-3B、Survivin-△Ex3 和Survivin2α[17]。Survivin的不同亞型及不同的細胞定位可能導致其凋亡和抗凋亡之間的功能存在差異。Survivin-2B和Survivin-△Ex3在腫瘤的發(fā)展中顯示了不同的作用，存在著復雜的調(diào)節(jié)平衡，這種平衡的調(diào)節(jié)在腫瘤的形成中具有重要作用[18]。

國外有文獻報道，Survivin-△Ex3主要表達于惡性腫瘤，而Survivin-2B主要表達于良性腫瘤。張恩等[19]采用PCR對52例胃腸道腫瘤患者外周血Survivin-△Ex3 mRNA表達進行了檢測，結(jié)果顯示，腫瘤患者Survivin-△Ex3 mRNA表達高于對照組。另外，Survivin不同剪接變異體與腫瘤患者預后的關(guān)系也很復雜，據(jù)文獻報道，在非小細胞肺癌患者中，Survivin-2B相對于Survivin-△Ex3的大量表達與Survivin-△Ex3相對于Survivin-2B的大量表達來說具有更好的預后[20]。

本研究通過qRT-PCR檢測了90例不同癌種患者和30例健康體檢者外周血Survivin及其剪接變異體的表達，其中擴增結(jié)直腸癌標本23例，胃癌標本22例，乳腺癌標本22例，肺癌標本23例，結(jié)果顯示，腫瘤患者Survivin、Survivin-△Ex3較對照組顯著高表達，而Survivin-2B較對照組顯著低表達。

有研究表明，在不同癌種患者中Survivin及其剪接變異體——Survivin-2B、Survivin-△Ex3表達是不同的，目前，腫瘤檢測研究大多針對活體組織，創(chuàng)傷大，通過靜脈采血的方式檢測外周血Survivin及其剪接變異體——Survivin-2B、Survivin-△Ex3的表達，且通過實驗表明，Survivin作為腫瘤標志物與肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌常用的標志物比較，靈敏度較高。這種無創(chuàng)、簡單檢查的高靈敏度非常適合具有高復發(fā)率的腫瘤疾病，使Survivin及其剪接變異體可能成為檢測腫瘤的標志物之一，也可作為腫瘤標記分子及預后的檢測指標應用于臨床，具有良好的研究及應用前景。