蘋果與膠孢炭疽菌互作研究進(jìn)展

冀志蕊　王美玉　張樹武　杜宜南　叢佳林　徐秉良　周宗山

摘? ? 要：膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）能夠引發(fā)蘋果苦腐病和蘋果炭疽葉枯病，危害葉片和果實(shí)，影響果品產(chǎn)量和品質(zhì)，給蘋果產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)蘋果與病原物互作分子機(jī)制最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，包括蘋果上炭疽病的病原菌組成和分類、侵染循環(huán)及其引發(fā)的果樹病害種類，病原菌的致病結(jié)構(gòu)和降解酶類、致病相關(guān)基因的挖掘與分析、效應(yīng)蛋白的篩選與功能分析等致病相關(guān)分子機(jī)制，蘋果被侵染后生理生化變化、激素信號(hào)、抗病基因挖掘、miRNA參與的免疫調(diào)控機(jī)制等抗病相關(guān)的研究?jī)?nèi)容，以期為解析病原菌致病機(jī)制及與寄主互作機(jī)制，進(jìn)而為挖掘潛力候選基因，以及病害綜合防控和抗病分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蘋果；膠孢炭疽菌；侵染機(jī)制；抗病機(jī)制

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2024）06-1199-14

Advances in study of the interaction between apple and Colletotrichum gloeosporioides

JI Zhirui1， 2， WANG Meiyu2， ZHANG Shuwu1， DU Yinan2， CONG Jialin2， XU Bingliang1*， ZHOU Zongshan2*

（1College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， Gansu， China; 2Research Institute of Pomology， Chinese Academy of Agricultural Science， Xingcheng 125100， Liaoning， China）

Abstract： Colletotrichum gloeosporioides can cause apple bitter rot， and anthracnose leaf blight， resulting in affecting fruit yield and quality， and causing serious economic losses to the apple industry. According to the latest fungal classification system， the C. gloeosporioides species complex consists of 13 different species， including C. gloeosporioides， C. aenigma and C. fructicola et al. Among them， C. fructicola and C. gloeosporioides are important pathogenic fungi on various fruit trees. Meanwhile， C. gloeosporioides can also cause diseases on other fruit trees such as cherry， passion fruit， and kiwifruit. In order to better prevent and control diseases， we need to have a comprehensive understanding of the classification， pathogenic mechanisms， and host interaction mechanisms of the pathogens on apples. In the process of colonizing host tissue， a number of C. gloeosporioides genes participate in different phases of infection procedures， which include conidiation， appressorium morphogenesis， melanization and penetration， biotrophy， necrotrophy， and various transport activities. In recent years， research on the pathogenic molecular mechanism of C. gloeosporioides on apples has mainly focused on the cloning and analysis of pathogenic related genes， screening and identification of effector proteins， pathogenic enzymes， and colletotoxins of C. gloeosporioides. Fungi secrete enzymes such as pectin， keratin and cellulase could help them successfully infect their hosts. New studies have shown that the adapter protein gene GcAP1 can regulate the expression of endopolygalacturonase genes （CgPG1 and CgPG2）， pectin lyase genes （pnl-1， pnl-2）， and pectate lyase genes （pelA， pelB）， and GcAP1 is an important virulence factor of C. gloeosporioides. Currently， the successful application of PEG mediated genetic transformation and Agrobacterium mediated transformation in the study of C. gloeosporioides provides a basis for the development of pathogenic molecular mechanisms. It has been confirmed that the genes with different functions such as CgABCF2， CgCMK1， CgSET5， CgOpt1， CgNVF1， CgABCF2， CgChip6 are present in C. gloeosporioides， playing an important role in infecting apples. In addition， C2H2 transcription factors， cation stress response transcription factors CgSltA， CgCrzA， and CsHtf1 also play important roles in pathogen pathogenesis. During the infection process， C. gloeosporioides can also secrete a series of effectors to inhibit the host immune response， thereby promoting pathogen infection and colonization. Currently， scientists have analyzed the roles of effectors such as CfE12， CfEC92， and Sntf2 in C. gloeosporioides， laying the foundation for subsequent research on interactions of pathogen and host. In addition， C. gloeosporioides secrete toxins during the necrotrophic stage， causing necrosis of the host tissue. The research on apple disease resistance started relatively late， mainly focusing on germplasm resource identification， physiological and biochemical testing， disease resistance gene mining， plant hormone mediated disease resistance response， disease related transcription factors， and other mechanisms of action. Research has shown that after inoculation with anthrax fungus， the activities of superoxide dismutase （SOD）， polyphenol oxidase （PPO）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， and serotonin N-acetyltransferase （SNAT） in apple leaves increased， indicating that these enzymes are involved in the infection process of C. gloeosporioides. Plant hormones play an important role in plant defense and growth and development， and hormones related to plant immune responses include salicylic acid （SA）， jasmonic acid （JA）， ethylene （ET）， abscisic acid （ABA）， and so on. Research has shown that there are significant differences in the expression levels of SA synthesis related genes MdEDS1， MdPAD4， MdPAL and SA signal transduction related genes MdNPR1， MdPR1 and MdPR5 between resistant and susceptible varieties. There are differences in the resistance and susceptibility of different apple varieties to C. gloeosporioides. The Hanfu variety has been used to screen for resistance genes due to its high resistance to C. gloeosporioides. WRKY and NAC transcription factors play a crucial role in plant resistance to pathogen infection. In apples， transcription factors MdWRKY15， MdWRKY17， and MdWRKY100 enhance apple resistance to anthracnose by regulating SA accumulation. Here， we plotted the downstream regulatory patterns of AtwrKY33 and MdWRKYs involved in the MAPK cascade reaction， and presented some research results on MdWRKYs. At the end of the article， we summarized the research results on the regulatory mechanism of miRNA involvement in plant immunity. Clarifying the pathogenic process and molecular mechanism of the pathogen is of great significance for the comprehensive prevention and control of C. gloeosporioides. With the deepening of various studies， researchers will inevitably change their thinking on the prevention and control of C. gloeosporioides. Traditional chemical prevention and control methods， such as the extensive use of fungicides and insecticides， can achieve the effect of combating pathogens， but they also can cause serious harm to the environment and people. Breeding of resistant varieties is a fundamental means to solve the problems in preventing and controlling C. gloeosporioides. This article aimed to analyze the pathogenic mechanism of pathogens and their interaction with hosts， laying a theoretical foundation for screening potential candidate genes and breeding new varieties resistant to diseases.

Key words： Apples; Colletotrichum gloeosporioides; Infection mechanism; Disease resistance mechanisms

炭疽菌（Colletotrichum）屬小叢殼科刺盤孢屬真菌，有性型為子囊菌門盤菌亞門小叢殼屬，在溫暖和潮濕的條件下易暴發(fā)流行，是世界上重要的植物病原菌之一[1]。炭疽菌可分為14個(gè)復(fù)合種和部分種，膠胞炭疽菌（C. gloeosporioides）是重要的一個(gè)復(fù)合種，能侵染1000余種作物，危害枝干、葉部、果實(shí)等部位，造成果實(shí)腐爛、植株枯萎甚至死亡。

C. gloeosporioides通過“半活體營(yíng)養(yǎng)”寄生并侵染寄主植物[2]，在整個(gè)侵染周期主要有活體營(yíng)養(yǎng)型（biotrophic）和死體營(yíng)養(yǎng)型（necrotrophic）兩種營(yíng)養(yǎng)模式。在侵染初期活體營(yíng)養(yǎng)階段，菌體不會(huì)立即殺死周邊寄主細(xì)胞，而是感應(yīng)寄主表面的物理和化學(xué)信號(hào)（植物表面硬度、疏水性、葉片紋理、植物激素等），產(chǎn)生初侵染菌絲攝取寄主體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和能源。在侵染后期，分化出次生菌絲并迅速擴(kuò)展，分泌細(xì)胞壁降解酶導(dǎo)致植物組織形成壞死斑，后轉(zhuǎn)換為死體營(yíng)養(yǎng)[3-5]，其生活史和侵染過程如圖1所示。

目前，生產(chǎn)上對(duì)炭疽病的防控以化學(xué)農(nóng)藥為主，隨著人們對(duì)果品安全的逐漸重視，科研人員開展了藥劑篩選和復(fù)配[6]、農(nóng)藥助劑應(yīng)用[7]及植物免疫誘抗劑使用等[8]藥劑減量增效研究。盡管對(duì)蘋果炭疽病菌的侵染和致病研究取得一定進(jìn)展，但因其種群多樣、侵染過程復(fù)雜，對(duì)其侵染致病機(jī)制和果樹抗性機(jī)制的研究仍有待深入。筆者在本文中將圍繞蘋果膠孢炭疽菌病原學(xué)、病原菌致病機(jī)制及果樹抗性機(jī)制展開論述。

1 侵染蘋果的膠孢炭疽菌復(fù)合群概述

膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）能夠引發(fā)蘋果果實(shí)炭疽?。╝pple bitter rot）和蘋果炭疽葉枯?。℅lomerella leaf spot of apple，GLSA），也能引發(fā)果實(shí)采后炭疽病。膠孢炭疽菌復(fù)合種（C. gloeosporioides complex）是蘋果上主要的病原菌，包含果生刺盤孢（C. fructicola）、隱秘刺盤孢（C. aenigma）、膠孢刺盤孢（C. gloeosporioides）等13種不同炭疽菌，其中C. fructicola和C. gloeosporioides是多種果樹的重要致病菌，可以在無傷條件下成功侵染寄主[9-10]。除蘋果外，C. gloeosporioides還可引發(fā)櫻桃、百香果、獼猴桃等果樹病害[10-15]（表1）。

2 膠孢炭疽菌致病分子機(jī)制

隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，膠孢刺盤孢（C. gloeosporioides）、希金斯刺盤孢（C. higginsianum）、禾生刺盤孢（C. graminicola）、東方刺盤孢（C. orbiculare）等全基因組測(cè)序組裝完成并公布。在此基礎(chǔ)上，PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化[25]和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化[26]在蘋果炭疽菌研究中成功應(yīng)用，為病原菌致病分子機(jī)制的解析提供了理論依據(jù)[22-23]。近年來蘋果上膠孢炭疽菌致病分子機(jī)制的研究主要集中在致病結(jié)構(gòu)和降解酶測(cè)定、致病基因的克隆與分析、效應(yīng)蛋白篩選與功能研究及炭疽菌毒素等方面（圖2）[27-29]。

2.1 膠孢炭疽菌致病結(jié)構(gòu)和降解酶

炭疽菌要穿透寄主的表皮組織，需要對(duì)寄主組織施加機(jī)械壓力，即孢子萌發(fā)時(shí)形成的附著胞及其胞內(nèi)組合液產(chǎn)生膨壓，壓力施加至附著胞下部的侵染釘，當(dāng)壓力到達(dá)一定程度時(shí)直接穿透植物表皮而侵入，構(gòu)成侵染和定殖[30]。黑化附著胞的形成可能涉及一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括分泌特定的分子、改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以提供附著支持等[31]。

植物的細(xì)胞壁是抵御病原菌侵入的天然屏障，病原菌通過分泌產(chǎn)生果膠酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶等降解酶類物質(zhì)破壞寄主細(xì)胞壁，輔助其侵染和定殖。薛蓮[32]對(duì)蘋果采后炭疽病菌細(xì)胞壁降解酶活性進(jìn)行分析，明確聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纖維素酶（Cx）在病原菌侵染中發(fā)揮重要作用。研究表明，銜接蛋白GcAP1復(fù)合體分布于細(xì)胞質(zhì)中，GcAP1基因能夠調(diào)控多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶基因（CgPG1、CgPG2）、果膠裂解酶基因（pnl-1、pnl-2）及果膠酸酯裂解酶基因（pelA、pelB）的表達(dá)，從而影響炭疽菌的生長(zhǎng)發(fā)育和毒力[33]。研究表明，膠孢炭疽菌pH依賴性轉(zhuǎn)錄因子CgPacC能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞壁降解酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和抗氧化劑的表達(dá)，在病原菌定殖中發(fā)揮重要作用[34]。

2.2 膠孢炭疽菌侵染階段相關(guān)致病基因挖掘與分析

C. gloeosporioides成功侵染定殖包括分生孢子萌發(fā)、附著胞形成、黑色素生成、侵染釘穿透寄主組織等不同階段，涉及的基因及其調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，目前的研究以單一基因?yàn)橹鳌?/p>

Zhao等[35]證實(shí)蘋果炭疽葉枯病菌染色質(zhì)調(diào)節(jié)基因CgSET5在菌絲生長(zhǎng)、分生孢子形成、附著胞形成、細(xì)胞壁完整性、致病性中發(fā)揮重要作用，并同時(shí)參與過氧化物酶體的生物反應(yīng)，是C. gloeosporioides的核心致病調(diào)節(jié)因子。該團(tuán)隊(duì)在后續(xù)研究中證實(shí)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CgMCT1參與了C. gloeosporioides營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、黑色素形成、分生孢子形成，且參與寄主體內(nèi)ROS降解[27]。Zhou等[28]發(fā)現(xiàn)當(dāng)炭疽菌CgABCF2基因缺失后，菌絲生長(zhǎng)速率和附著胞數(shù)量顯著下降，導(dǎo)致致病性喪失。張俊祥等[36-37]研究證實(shí)CgCMK1、CgNVF1在炭疽菌分生孢子和附著胞中的表達(dá)，對(duì)分生孢子產(chǎn)量、附著胞形成、氧化脅迫應(yīng)答反應(yīng)及致病性等方面均有影響。徐杰[38]證實(shí)蘋果炭疽葉枯病菌基因GTPBP1在調(diào)控附著胞的形成中發(fā)揮作用。譚清群[39]研究證實(shí)氨甲酰磷酸合成酶（carbamyl phosphate synthase，CPS）小亞基基因Cpa1通過調(diào)控精氨酸的合成從而影響病原菌致病力。研究表明，寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CgOpt1在菌絲中表達(dá)，參與真菌對(duì)IAA反應(yīng)的調(diào)節(jié)，通過影響產(chǎn)孢和色素沉積來降低病菌的致病性[40]。甾醇糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因CgChip6參與分生孢子萌發(fā)和附著胞的形成，該基因缺失后病原菌毒力顯著下降[41]。Liang等[42]對(duì)果生炭疽菌（C. fructicola）1104-7基因組進(jìn)行了測(cè)序和組裝，獲得了高質(zhì)量參考基因組，為C. fructicola致病相關(guān)基因的研究提供了重要的理論和數(shù)據(jù)支撐。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控膠孢炭疽菌分子機(jī)制

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行特異性互作，從而調(diào)控目的基因的表達(dá)強(qiáng)度，可分為4類，即鋅指蛋白（包括3類：C2H2、C4和C6）、堿性亮氨酸拉鏈、堿性螺旋環(huán)螺旋和同源異形盒類轉(zhuǎn)錄因子[43]。已有研究表明，膠孢炭疽菌的轉(zhuǎn)錄因子在表達(dá)調(diào)控中能起到協(xié)調(diào)作用，能夠促進(jìn)附著胞黑化和定殖。C2H2鋅指蛋白型轉(zhuǎn)錄因子CgAzf1、CgCrzA及CgGcp1能夠調(diào)控黑色素生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)，參與分生孢子的萌發(fā)和侵染過程[31，44-45]。CfSte12能夠調(diào)控與附著胞功能相關(guān)的四次穿模蛋白PLS1（tetraspanin PLS1）、Gas1樣蛋白（Gas1-like proteins）、角質(zhì)酶和黑色素合成的基因表達(dá)[46]。陽離子脅迫反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子CgSltA、CgCrzA及CsHtf1在炭疽菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、分生孢子產(chǎn)生、附著胞形成和致病性等方面均發(fā)揮重要作用[45，47]。堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子CgAP1在C. gloeosporioides中起氧化還原傳感器的作用[48-49]。轉(zhuǎn)錄因子CfMcm1是C. fructicola的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在病原菌無性繁殖、黑色素形成、致病性、果膠酶降解等過程中發(fā)揮作用[50]。

2.4 效應(yīng)蛋白篩選及功能研究

在侵染過程中，炭疽菌通過分泌一系列效應(yīng)蛋白抑制寄主免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)病原菌的侵染和定殖[51-52]，不同侵染階段所分泌的效應(yīng)因子功能不同[3，53]。隨著基因組測(cè)序的應(yīng)用，炭疽菌中多個(gè)候選的效應(yīng)因子被成功篩選鑒定[54-55]。真菌胞外膜蛋白CFEM（common in several fungal extracellular membrane）是真菌所獨(dú)有的蛋白結(jié)構(gòu)域，與病原菌致病性密切相關(guān)。Shang等[56]研究證實(shí)，刺盤孢屬真菌CFEM型效應(yīng)因子CfEC12能夠與蘋果中MdNIMIN2互作，與水楊酸受體NPR1競(jìng)爭(zhēng)MdNIMIN2蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制蘋果抗性基因的表達(dá)和免疫反應(yīng)。LysM型效應(yīng)蛋白可以保護(hù)真菌細(xì)胞壁免受植物幾丁質(zhì)酶的作用或隔離釋放的殼寡糖，從而避免被植物的防御系統(tǒng)識(shí)別，其具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性，可以結(jié)合幾丁質(zhì)從而抑制植物的PTI（pattern-triggered immunity），促進(jìn)病原菌的侵染[57]。Shang等[58]研究證實(shí)C. fructicola中效應(yīng)蛋白CfEC92在早期附著胞生成和附著胞介導(dǎo)的滲透階段上調(diào)表達(dá)，抑制蘋果的PTI和相關(guān)防御基因表達(dá)，促進(jìn)病原菌侵染。王美玉[59]開展效應(yīng)蛋白Sntf2功能研究，證實(shí)其能夠與葉綠體組裝因子Mdycf39互作干擾葉綠體功能，從而抑制寄主植物的免疫反應(yīng)，促進(jìn)C. gloeosporioides的侵染和定殖。

2.5 膠孢炭疽菌毒素

炭疽菌在死體營(yíng)養(yǎng)階段通過分泌毒素造成寄主組織壞死。目前，對(duì)于炭疽菌毒素的研究多集中在毒素生物學(xué)測(cè)定、成分鑒定純化階段。C. gloeosporioides產(chǎn)生的毒素為非寄主?；远舅兀軌蚯秩径喾N寄主。Khodadadi等[60]分離鑒定了蘋果苦腐病病原菌，明確其毒素能夠?qū)?種不同樹種造成危害，關(guān)于炭疽菌的毒素和作用機(jī)制仍然有待進(jìn)一步深入研究。

3 蘋果抗膠胞炭疽菌侵染的分子機(jī)制

果樹在自然環(huán)境中會(huì)受到各類病原物的侵染，為了抵御病原菌的侵染，植物進(jìn)化出識(shí)別和抵御病原菌的PTI和ETI兩層免疫系統(tǒng)[61]。第一層免疫系統(tǒng)是由植物細(xì)胞質(zhì)膜上的模式識(shí)別受體感知微生物相關(guān)分子模式（microbe-associated molecular pattern，MAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMPs）而觸發(fā)一系列的免疫反應(yīng)，稱為“模式觸發(fā)免疫”（PTI），該免疫反應(yīng)包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）的激活及抗病基因表達(dá)量上調(diào)等[62-63]。病原菌為了應(yīng)對(duì)植物的PTI免疫反應(yīng)進(jìn)化出毒力蛋白（效應(yīng)因子），抑制植物PTI反應(yīng)，從而成功侵入，這一中間過程被稱為“效應(yīng)因子觸發(fā)的易感性”，即EST（effector-triggered susceptibility）。最后，植物進(jìn)化出識(shí)別和抵御這些效應(yīng)子的胞內(nèi)NLR來誘導(dǎo)更為強(qiáng)大的抗性反應(yīng)，即第二層免疫“效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫”，ETI（effector-triggered immunnity）[64-65]。ETI的免疫反應(yīng)主要包括程序性細(xì)胞死亡的過敏性反應(yīng)（hypersensitive responses，HR）、Ca2+內(nèi)流、胼胝質(zhì)的沉積等。植物在PTI和ETI期間，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)幅度和時(shí)間有所不同，但所觸發(fā)的免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和下游反應(yīng)有所重疊[66-68]。

蘋果抗炭疽病的研究起步相對(duì)較晚，主要開展了種質(zhì)資源鑒定[69]、生理生化檢測(cè)、抗病基因挖掘、植物激素介導(dǎo)的抗病反應(yīng)及抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[70]作用機(jī)制等研究。

3.1 生理生化變化

研究表明接種炭疽菌后，嘎拉和富士葉片內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多酚氧化酶（polyphenoloxidas，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、5-羥色胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶（SNAT）的活性增強(qiáng)，其相關(guān)基因表達(dá)量呈先升后降的趨勢(shì)，表明以上酶類參與了炭疽葉枯病菌的侵染過程[71-72]。蘋果不同組織被炭疽菌侵染后，PPO、POD、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）等7種酶活性均有不同程度的提高[73-75]。通過分析不同抗感品種感染炭疽菌后細(xì)胞壁降解酶活性的變化，證實(shí)甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纖維素酶（Cx）在病菌侵染過程中發(fā)揮作用，且抗病品種中細(xì)胞壁降解酶活性高峰的出現(xiàn)早于感病品種[76]。白靜科[30]比較了C. fructicola侵染后抗感品種中過氧化氫（H2O2）和乳突產(chǎn)生的差異，發(fā)現(xiàn)炭疽菌的侵染誘導(dǎo)了蘋果細(xì)胞中H2O2的積累和乳突的產(chǎn)生，并隨著侵染時(shí)間延長(zhǎng)不斷積累。此外，生防菌也可以通過提高感病品種嘎拉葉片中POD、CAT、SOD等防御酶活性，減少活性氧的積累，從而誘導(dǎo)蘋果對(duì)炭疽菌的抗性[77]。

3.2 植物激素

植物激素在植物防御和生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，與植物免疫反應(yīng)相關(guān)的激素包括水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）、脫落酸（ABA）等。SA和JA-ET激素作為重要的調(diào)控因子，在蘋果生物和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[78-79]。SA是通過異分支酸合成酶（ICS）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）途徑合成。在應(yīng)激條件下，超過90%的受刺激SA是通過ICS合成的[80]。當(dāng)沒有遇到病原體或逆境時(shí)，植物細(xì)胞積累相對(duì)較低濃度的SA，外源噴施SA可增強(qiáng)抗病相關(guān)酶的活性，誘導(dǎo)高感蘋果品種對(duì)C. gloeosporioides產(chǎn)生抗性[81-82]。在蘋果中，藤牧1號(hào)、40-9及16-16等抗性品種（系）中SA合成相關(guān)基因MdEDS1、MdPAD4和MdPAL被C. gloeosporioides誘導(dǎo)表達(dá)，SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因MdNPR1、MdPR1、MdPR5的表達(dá)量顯著高于嘎拉等感病品種（系）[83]。水楊酸合成途徑中的關(guān)鍵酶MdICS1可以被G. cingulata誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而JA、ABA和ETH三種外源信號(hào)可抑制其表達(dá)。

3.3 蘋果抗病基因挖掘

不同蘋果品種對(duì)炭疽菌抗感表現(xiàn)存在差異，在田間蘋果炭疽葉枯病的表現(xiàn)尤為突出[84]。馬玉鑫[85]研究表明，寒富品種CDPK基因家族成員MdCDPK24基因在炭疽菌侵染后顯著上調(diào)表達(dá)。對(duì)寒富蘋果同源四倍體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)MdCaMBP6、MdIPT8在蘋果炭疽葉枯病菌侵染后顯著上調(diào)表達(dá)，能夠提高品種抗性[86-87]。Guo等[88]報(bào)道湖北蘋果M. hupehensis YT521-B同源結(jié)構(gòu)域包含蛋白2（MhYTP2），其與MdRGA2L mRNA結(jié)合并降低其穩(wěn)定性，在調(diào)節(jié)對(duì)炭疽葉枯病的抗性中發(fā)揮重要作用，可用于開發(fā)具有GLS抗性的蘋果品種。劉源霞等[89]采用分離群體分組分析（BSA）方法，篩選獲得了一個(gè)與抗病性狀相關(guān)的分子標(biāo)記S0506206-24，在此基礎(chǔ)上，采用全基因組重測(cè)序和BSA相結(jié)合的方法，在該雜交群體中定位了1個(gè)蘋果抗炭疽葉枯病基因位點(diǎn)Rgls，并將其精細(xì)定位于標(biāo)記InDel4199和SNP4299之間[90]，室內(nèi)接種驗(yàn)證與Rgls位點(diǎn)緊密連鎖的4個(gè)分子標(biāo)記S0405127（SSR）、S0304673（SSR）、SNP4236和InDel4254，準(zhǔn)確率均高于90%[91]。

3.4 抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子參與的防御反應(yīng)

植物被病原物感染后，當(dāng)病原體相關(guān)的分子模式（PAMP）或效應(yīng)器被植物識(shí)別時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)可以被激活，導(dǎo)致活性氧簇（ROS）的產(chǎn)生、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）激活和防御基因的表達(dá)[62]。MAPKs能夠靶向并磷酸化調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，最終響應(yīng)病原菌的侵入。已報(bào)道的與炭疽菌侵染響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有AP2/ERF、TGACG基序結(jié)合因子（BZIP）、MYC2（BHLH）、ARF、MYB、WRKY和NAC等7種，后兩者是高等植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族[92]。WRKYs轉(zhuǎn)錄因子作為MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要靶標(biāo)，在植物對(duì)病原菌的抗性中起關(guān)鍵作用。當(dāng)病原菌侵入后，SA依賴的WRKY基因會(huì)迅速表達(dá)并積累，與抗病基因啟動(dòng)子上的W盒[W-box，TTGAC（C/T）]特異性結(jié)合，啟動(dòng)防御反應(yīng)，從而形成復(fù)雜的WRKY調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在蘋果中，MKK4-MPK3下游轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY15、MdWRKY17及MdWRKY100通過調(diào)控SA積累增強(qiáng)蘋果對(duì)炭疽菌的抗性[70，93]。其中，MdWRKY100正向調(diào)節(jié)蘋果對(duì)C. gloeosporioides的抗性；C. fructicola可提高感病品種中MdWRKY17蛋白積累，誘導(dǎo)MdMEK4-MdMPK3-MdWRKY17-MdDMR6-SA途徑，加速SA降解，從而降低果樹抗性[94]。此外，有研究表明，MdWRKY15通過激活SA合成酶MdICS1的表達(dá)增強(qiáng)對(duì)輪紋病的抗性[95]。酯酶/脂肪酶GELP1是MPK3/MPK6及其下游轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY100的靶標(biāo)，在蘋果抵御病原菌侵染中發(fā)揮重要作用[96]。Li等[97]和Lippok等[98]研究證實(shí)，γ-氨基丁酸（GABA）關(guān)鍵合成基因MdGAD1能夠與MdWRKY33互作，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織形成和葉片的抗氧化能力，正向調(diào)控蘋果對(duì)C. gloeosporioides的抗性。此外，MdWRKY31能夠與蘋果超敏反應(yīng)蛋白MdHIR4（hypersensitive-induced reaction? protein，HIR）相互作用，影響SA信號(hào)通路中基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)蘋果對(duì)葡萄座腔菌B.dothidea的抗性[99]。MdWRKY75能夠與MdRAC7啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)漆酶的生物合成，并在蘋果斑點(diǎn)落葉病菌Alternaria alternata感染期間促進(jìn)了木質(zhì)素的合成[100]。最新研究表明，MdVQ10能夠與MdWRKY75互作，增強(qiáng)衰老相關(guān)基因MdSAG12和MdSAG18的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)葉片損傷引發(fā)的衰老進(jìn)程[101]。然而，以上幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是否在蘋果對(duì)炭疽菌抗性中也發(fā)揮著相同或類似的作用仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證（圖3）。

3.5 miRNA參與植物免疫的調(diào)控機(jī)制

非編碼的RNA分為微小RNA（microRNAs，miRNAs）和小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNA）兩大類，miRNA是植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答中重要的調(diào)控因子[102]。miRNA可能參與調(diào)節(jié)病原菌感染中胼胝質(zhì)沉積過程，在模式植物擬南芥中，miR773靶向抑制甲基轉(zhuǎn)移酶2（MET2），影響胼胝質(zhì)沉積和ROS累積，負(fù)調(diào)控C. higginianum的抗病性[103]。Zhang等[104]研究發(fā)現(xiàn)，Md-miRln20靶向Md-TN1-GLS負(fù)調(diào)控蘋果對(duì)膠孢炭疽菌的侵染。此外，Zhang等[105]研究證實(shí)兩種CCR-NB-LRR蛋白MdRNL2和MdRNL6能夠形成復(fù)合物，抑制病原菌生長(zhǎng)，提高了蘋果樹對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌A. alternata的抗性，進(jìn)一步研究證實(shí)其同樣能夠提高果樹對(duì)C. gloeosporioides的抗性[106]。張亞楠等[107]分析了抗感品種中抗病相關(guān)miRNA的表達(dá)量差異，預(yù)測(cè)miR390a、miR482b及miR396b/c/f 在蘋果被炭疽菌侵染中發(fā)揮重要作用。Shen等[108]研究發(fā)現(xiàn)，Mdm-miR160-MdARF17-MdWRKY33模塊能夠通過調(diào)節(jié)活性氧（ROS）提高蘋果耐寒性能，但其對(duì)病原菌致病力的影響仍未證實(shí)。上述結(jié)果對(duì)果樹抗病育種起重要的推動(dòng)作用。

4 問題與展望

近年來，在分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的推動(dòng)下，蘋果和炭疽菌互作方面的研究取得了巨大進(jìn)展。筆者詳細(xì)闡述了蘋果炭疽菌組成、病原菌侵染相關(guān)基因及其與寄主互作的研究進(jìn)展。明確病原菌致病過程及其分子機(jī)制，對(duì)蘋果炭疽葉枯病的綜合防控具有重要意義，隨著各項(xiàng)研究的日益深入，研究者對(duì)炭疽病的防控思路必將有所轉(zhuǎn)變。

炭疽菌對(duì)蘋果產(chǎn)業(yè)造成巨大危害，由于炭疽菌具有潛伏侵染的特性，果樹病害監(jiān)測(cè)不僅耗時(shí)費(fèi)力，還存在一定的技術(shù)難題。利用傳統(tǒng)的化學(xué)防控手段，通過大量使用殺菌劑和殺蟲劑等雖能達(dá)到對(duì)抗病原菌的效果，但對(duì)環(huán)境和人體也會(huì)造成嚴(yán)重的危害。隨著生活水平的不斷提高，健康問題已經(jīng)逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，研發(fā)生態(tài)友好型生物防治策略已經(jīng)被人們廣泛接受和認(rèn)可，前景一片光明。開展抗性品種選育是從根本上解決果樹炭疽菌防控難問題的有效手段，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)需求[109-110]。解析抗病機(jī)制能夠?yàn)樘O果抗病性改良提供重要的理論依據(jù)，是果業(yè)科研的重點(diǎn)研究領(lǐng)域。

生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的各種先進(jìn)技術(shù)為作物改良提供了其他途徑，能夠極大地縮短果樹育種周期，解決傳統(tǒng)實(shí)生苗選育耗時(shí)長(zhǎng)的難題。通過構(gòu)建蘋果高效遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)一步開展基因編輯、RNA干擾等生物育種技術(shù)研究，培育具有優(yōu)良性狀的蘋果新種質(zhì)或新品種是果樹科研工作者努力的方向[110]。

總之，了解蘋果與炭疽菌互作的分子機(jī)制，能夠?yàn)榕嘤共∑贩N和創(chuàng)新病害防控策略提供新的見解，對(duì)果樹產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

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收稿日期：2024-03-13 接受日期：2024-04-07

基金項(xiàng)目：中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1610182023012）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-27）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程專項(xiàng)（CAAS-ASTIP-2021-RIP-05）

作者簡(jiǎn)介：冀志蕊，女，在讀博士研究生，研究方向?yàn)楣麡洳『α餍信c綜合防控。Tel：0429-3598236，E-mail：xinyu_jzr@163.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：xubl@gsau.edu.cn；Tel：0429-3598268，E-mail：zhouzongshan@caas.cn