SDS-PAGE法分析不同加工方法對雞蛋蛋白質(zhì)組成的影響

曹金虎，王令冉，羅靜波，俞海東，韓榮勛

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025)

禽蛋類是我國人民膳食蛋白質(zhì)的重要來源。其中，雞蛋的蛋白質(zhì)生理價值最高，也是人們?nèi)粘Ｊ秤米疃嗟牡邦悺ｋu蛋的蛋白質(zhì)生理價值高達(dá)94，而牛奶、牛肉、豬肉分別為85、76和74。雞蛋的蛋清由約87%的水、11%的蛋白質(zhì)、微量的脂質(zhì)以及少量的礦物質(zhì)和維生素等組成；而蛋黃由約51%的水、31%的脂肪、17%的蛋白質(zhì)、少量礦物質(zhì)以及多種維生素等組成[1]。然而，不同的加工方法會導(dǎo)致雞蛋中的蛋白質(zhì)發(fā)生各種不同的改變。

目前我國蛋類制品主要有松花蛋、咸蛋、香鹵蛋、茶葉蛋、熏蛋、鹵雞蛋等傳統(tǒng)加工蛋制品[2]。其中松花蛋和咸蛋在我國的加工歷史已有600余年。20世紀(jì)90年代末期開始，蛋類產(chǎn)品的二次加工有了一定程度的發(fā)展。如1998年胡久莉等[3]研究了烤蛋的制作方法。同年，周大偉[4]對五香熏蛋的制作方法進(jìn)行了介紹。2000年馬儷珍等[5]對咸金蛋(咸雞蛋)的加工工藝進(jìn)行了研究，2001年彭艷等[6]研制出速凍食品-甜蛋，吳紅梅等[7]對五香熏蛋的制作方法進(jìn)行了改進(jìn)，岳國璋等[8]對無鉛雞蛋皮蛋的加工技術(shù)進(jìn)行了研究。而到了近幾年，魏明英等[9]研制出茶葉雞蛋干，2017年王秀娟[10]對醬鹵雞蛋工藝進(jìn)行了研究。這些研究將重點放在雞蛋制品的加工工藝和產(chǎn)品的色、香、味等產(chǎn)品外觀和口感質(zhì)量方面，但并未關(guān)注這些蛋類制品在加工前后的蛋白質(zhì)組成變化。到目前為止，對雞蛋蛋白質(zhì)組成方面的研究主要集中在加工對雞蛋中致敏性物質(zhì)的免疫反應(yīng)性和加工過程中蛋白質(zhì)凝膠特性的變化[11,12]，或是以蛋白組學(xué)方法分析雞蛋中各組分的蛋白質(zhì)組成等方面的研究[13～16]。

本研究采用SDS-PAGE電泳法比較分析煮雞蛋、茶葉蛋、熟咸雞蛋、鹽焗雞蛋、鹵雞蛋及生鮮雞蛋的蛋白質(zhì)組成，從而觀察雞蛋蛋白質(zhì)組成在采用不同加工方法進(jìn)行加工后所發(fā)生的變化，以期為實驗室檢測雞蛋全蛋制品是否存在摻假及是否以次充好提供科學(xué)數(shù)據(jù)，也為人們選擇更容易消化吸收的雞蛋制品提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和準(zhǔn)備

實驗樣品為從市場購買的生鮮雞蛋、煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋。樣品在實驗前去殼后加入適量超純水用勻漿機(jī)將全蛋攪拌均勻制成全蛋混合物。將100μL全蛋混合物樣品分別與等體積的裂解緩沖液(0.3%SDS、3%DTT、蛋白酶抑制劑和0.5mol/LTris/HCl，pH8.0)充分混合后在低溫條件下對樣品進(jìn)行超聲波粉碎處理。在室溫條件下反應(yīng)1h后，在4℃、12000r/min條件下離心20min去除沉淀物。取上清液，以1mg/mL牛血清白蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用Bradford法測定蛋白濃度后分裝成每管120μg樣品并保存于-70℃冰箱中。

1.2 SDS-PAGE分析

本研究中SDS-PAGE分別采用8%和12%的分離膠[1.5mol/L Tris(pH8.8)、40%Acry/Bis(29∶1)、蒸餾水、10% SDS、10% APS、TEMED]，并采用同等蛋白質(zhì)含量的上樣方法，上樣順序為Marker、120μg生鮮雞蛋、120μg煮雞蛋、120μg茶葉蛋、120μg咸雞蛋、120μg鹽焗雞蛋和120μg鹵雞蛋,在100V電壓條件下進(jìn)行分離。

電泳結(jié)束后取出凝膠，經(jīng)超純水漂洗后將凝膠放入固定液[30%(體積比)甲醇、10%(體積比)醋酸]中固定，1h后取出凝膠放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色24h。染色結(jié)束后用脫色液(1%醋酸)脫色后進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果與分析

將相同蛋白質(zhì)質(zhì)量的生鮮雞蛋、煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋全蛋蛋白在相同電泳條件下分別用8%、12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，所得的電泳圖譜分別見圖1和圖2。

M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1:生鮮雞蛋；2：煮雞蛋；3:茶葉蛋；4:咸雞蛋；5:鹽焗雞蛋；6:鹵雞蛋 圖1 用8%分離膠分離所得生鮮雞蛋、煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋全蛋蛋白電泳圖譜

M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1:生鮮雞蛋；2：煮雞蛋；3:茶葉蛋；4:咸雞蛋；5:鹽焗雞蛋；6:鹵雞蛋 圖2 12%分離膠生雞蛋、煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋全蛋蛋白電泳圖譜

由圖1可以看出，在8%的分離膠中生鮮雞蛋分別在200、100、60、40ku和20ku附近存在明顯的條帶，而煮雞蛋和茶葉蛋分別在120ku和85ku附近存在模糊的條帶，在70ku和60ku以下存在1條條帶，在40ku附近存在1條模糊的蛋白質(zhì)條帶。咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋雖然同樣在70ku以下存在1條蛋白質(zhì)條帶，而60ku附近只顯示模糊的條帶，在60ku以下不存在任何蛋白質(zhì)條帶。

由圖2可以看出，在12%的分離膠中生鮮雞蛋分別在200、100、60、50ku和30ku附近存在明顯的條帶，煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋在85ku附近存在1條模糊的條帶，煮雞蛋在70、60ku以下和40ku附近各存在1條條帶。而茶葉蛋中這幾條條帶相對于煮雞蛋顏色淡了很多，在40ku附近只能觀察到1條模糊的蛋白質(zhì)條帶。只有煮雞蛋和茶葉蛋在30ku附近存在模糊的蛋白質(zhì)條帶，而咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋在30ku附近不存在任何蛋白質(zhì)條帶。咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋雖然同樣在70ku以下存在1條蛋白質(zhì)條帶，但是這些條帶都相較于煮雞蛋而言淡了很多，而在60ku附近只顯示模糊的條帶，在60～20ku之間不存在任何蛋白質(zhì)條帶。在12%的分離膠中，煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋在20ku以下存在1條非常明顯的蛋白質(zhì)條帶，而在生鮮雞蛋中觀察不到這一條帶，并且所有樣品在8%分離膠中都觀察不到這一條帶，形成了鮮明的對比?？傮w來說，經(jīng)過加工后，雞蛋中20ku以上的蛋白質(zhì)條帶基本全部變淡，只在12%分離膠的20ku以下才存在1條非常明顯的蛋白質(zhì)條帶。

3 討論與結(jié)論

為了探討加工后雞蛋的蛋白質(zhì)組成變化，本研究采用SDS-PAGE法比較分析了生鮮雞蛋、煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋全蛋蛋白主要蛋白質(zhì)組成。結(jié)果表明，加工后的雞蛋制品的蛋白質(zhì)組成與未加工的生鮮雞蛋蛋白質(zhì)組成之間表現(xiàn)出了顯著差異。在8%分離膠凝膠電泳圖譜中能觀察到生鮮雞蛋有19條蛋白質(zhì)條帶，而加工后的各種雞蛋制品中的蛋白質(zhì)條帶數(shù)量顯著減少。如煮雞蛋和茶葉蛋只有4條蛋白質(zhì)條帶，而咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋只有3條蛋白質(zhì)條帶。同樣，在12%分離膠凝膠電泳圖譜中能觀察到生鮮雞蛋有16條蛋白質(zhì)條帶，而加工后的煮雞蛋和茶葉蛋只有6條蛋白質(zhì)條帶，咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋只有4條蛋白質(zhì)條帶，并且大部分蛋白質(zhì)都集中在20 ku以下的小分子量部分。12%分離膠由于較小的孔徑，其分離蛋白質(zhì)的速度較慢，在相同的電壓和分離時間下小分子量蛋白質(zhì)相對于8%的分離膠移動速度較慢。所以在相同的電泳條件下，在12%分離膠中能觀察到小分子量蛋白質(zhì)條帶，而在8%分離膠中觀察不到這些小分子量蛋白質(zhì)條帶。

本研究結(jié)果可為雞蛋的真?zhèn)舞b別提供參考。已報道的有關(guān)真假雞蛋鑒別的相關(guān)研究中，楊國武等[17]用雙向電泳方法分析了18個市售雞蛋的蛋白圖譜，并獲得了與真雞蛋的蛋黃蛋白質(zhì)共有的17個蛋白質(zhì)點，但并未對這些蛋白點進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。有關(guān)加工條件對雞蛋蛋白質(zhì)組成影響的研究中，楊元元[11]對不同加工條件對卵白蛋白免疫反應(yīng)性的影響研究中，發(fā)現(xiàn)濕熱60℃、濕熱100℃、干熱100℃、干熱150℃、高溫滅菌處理卵白蛋白樣品溶液對卵白蛋白的一級結(jié)構(gòu)并無影響。吳序櫟等[18]在進(jìn)行雞蛋過敏原分離、鑒定與純化的研究時發(fā)現(xiàn)蛋清與蛋黃蛋白粗提液按照每孔10μL上樣后蛋黃粗提液的主要蛋白質(zhì)條帶有6條；蛋清粗提液的主要蛋白質(zhì)條帶有5條。而在本研究中，生鮮雞蛋中能觀察到將近20條蛋白質(zhì)條帶。這可能與電泳時全蛋蛋白先用蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì)后再定量而且每個樣品上樣量均為120μg有關(guān)。而吳序櫟等[18]用蛋清與磷酸鹽緩沖液以1∶10的體積比混合后取10μL上樣，根據(jù)參考文獻(xiàn)推測其樣品上樣量大致為100μg。因此，不同蛋白質(zhì)提取方式和不同上樣量可能是造成最終觀察到的蛋白質(zhì)條帶數(shù)量不同的原因。

到目前為止，有關(guān)煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋全蛋蛋白與生鮮雞蛋全蛋蛋白比較的研究鮮有報道。本研究采用SDS-PAGE法比較分析了生鮮雞蛋和這些雞蛋加工產(chǎn)品的全蛋蛋白質(zhì)，揭示了雞蛋加工前后蛋白質(zhì)組成的變化以及不同加工方法對雞蛋蛋白質(zhì)組成變化的影響。本研究所獲得的結(jié)果對于實驗室檢測雞蛋全蛋制品是否摻假及是否以次充好提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，也為消費者選擇更容易消化吸收的雞蛋制品提供了參考。本研究采用的是比較簡便的SDS-PAGE法，所以只能觀察到不同加工方法導(dǎo)致的蛋白質(zhì)組分差異，要了解有表達(dá)差異的蛋白質(zhì)條帶的具體信息還需要進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定。