血必凈對(duì)免疫抑制膿毒癥模型的保護(hù)作用

張晶晶，孔憲斌，霍景瑞，王蕾，劉穎，陳鋒，楊曉暉，田毅，孫世中，陳旭義，黃夢(mèng)強(qiáng)，劉英富△

膿毒癥是公認(rèn)的世界性難題［1］，且治療費(fèi)用非常高昂［2］。隨著年齡的增長(zhǎng)，老年人出現(xiàn)免疫低下等狀況，可能會(huì)導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)病率增加［3］。免疫功能降低是膿毒癥的重要發(fā)病因素，而現(xiàn)有研究在評(píng)估藥物或新的治療手段時(shí)忽視了免疫抑制的起始因素，直接采用正常動(dòng)物進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)，與臨床膿毒癥發(fā)病過(guò)程相脫節(jié)［4］，這可能是導(dǎo)致目前膿毒癥有效治療藥物或技術(shù)推進(jìn)緩慢的重要原因［5］。本研究圍繞膿毒癥發(fā)病過(guò)程，構(gòu)建了模仿膿毒癥發(fā)病前免疫低下?tīng)顟B(tài)的新模型，為評(píng)估新模型，觀察了經(jīng)典膿毒癥藥物血必凈對(duì)新型免疫抑制膿毒癥模型的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性BALB/c小鼠，清潔級(jí)，6～8周齡，體質(zhì)量22～30 g，購(gòu)自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［北京，中國(guó)SCXK-（軍）2012-0004］。小鼠于無(wú)病原體的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水，室內(nèi)溫度（22±2）℃，人工光暗周期12 h，所有實(shí)驗(yàn)均遵循武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理規(guī)范。

1.1.2 試劑與儀器 環(huán)孢素A購(gòu)買于美國(guó)Med Chem Express公司；血必凈注射液購(gòu)自天津紅日藥業(yè)股份有限公司；肝素鈉注射液購(gòu)自山東惠諾藥業(yè)有限公司；大腸桿菌CMCC44102購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司；兔抗小鼠HMGB1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗小鼠β-Tubulin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自Millipore公司?？剐∈驝D3-FITC單克隆抗體、抗小鼠CD4-PE單克隆抗體、抗小鼠CD8-PerCP單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海喆圖科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)ACS CantoTMⅡ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman Coulter公司），Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Aplegen公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌懸浮液的制備及濃度測(cè)定 將大腸桿菌44102接種于100 mL的無(wú)菌培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)12 h，隨后分別在培養(yǎng)基中取1 mL進(jìn)行稀釋，稀釋梯度為10倍，稀釋到10-9倍。在10-5～10-9稀釋倍數(shù)中各取500 μL倒入裝有無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液充分平鋪，隨后倒置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)12 h的培養(yǎng)皿取出，計(jì)平板的細(xì)菌菌落形成單位（clonal formation unit，CFU），推算出原液中每毫升的細(xì)菌菌落形成數(shù)量（clonal formation unit/milliliter，CFU/mL）。

1.2.2 分組造模 雄性BALB/c小鼠152只，使用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照（Control）組，免疫抑制（IM）組，免疫抑制膿毒癥模型（ISM）組和血必凈治療（XT）組，每組各38只。IM組：小鼠禁食12 h后，沿下腹正中線旁邊腹腔注射環(huán)孢素A進(jìn)行免疫抑制，劑量為25 mg/kg，隔日1次，共3次［6-7］。ISM組免疫抑制小鼠后腹腔注射300 μL濃度為1×109CFU/mL的大腸桿菌44102；XT組免疫抑制膿毒癥造模后30 min，腹腔注射血必凈4 mL/kg［6］，30 min后按相同劑量重復(fù)注射血必凈1次；Control組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.2.3 流式細(xì)胞法測(cè)定CD3+CD4+、CD3+CD8+以及CD4+/CD8+造模12 h，各組取10只小鼠，通過(guò)取眼球法采血，肝素鈉抗凝，加入紅細(xì)胞裂解液處理10 min，至外周血無(wú)色清透，1 500 r/min離心5 min。取外周血分別加入抗小鼠CD3-FITC單克隆抗體、抗小鼠CD4-PE單克隆抗體、抗小鼠CD8-PerCP單克隆抗體。劇烈震蕩后，置于4℃冰箱孵育30 min，加入Hanks液洗滌離心，定容并上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在前散射光（FSC）和側(cè)散射光（SSC）散點(diǎn)圖中，設(shè)定淋巴細(xì)胞門，然后對(duì)淋巴細(xì)胞做PerCP、FITC、PE熒光強(qiáng)度檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+CD4+、CD3+CD8+，并用Flowjo軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.2.4 血細(xì)菌培養(yǎng) 造模8 h，各組取4只小鼠，小鼠眼眶靜脈叢無(wú)菌取血，肝素抗凝，各血液標(biāo)本10倍稀釋后分別取0.5 mL均勻涂布于LB固體平板，37℃孵育18 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并拍照，最終的計(jì)量單位為菌落形成單位（CFU）。

1.2.5 炎癥因子檢測(cè) 造模12 h，各組取10只小鼠，通過(guò)取眼球法采血，離心后取血清置于EP管中，-80℃凍存待測(cè)，ELISA法檢測(cè)炎癥因子TNF-α和IL-6水平。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western blot） 造模12 h，各組取4只小鼠，通過(guò)取眼球法采血，離心后取血清置于EP管中，小鼠血清經(jīng)生理鹽水適當(dāng)稀釋并用還原上樣緩沖液處理后，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，應(yīng)用濕式電轉(zhuǎn)移法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至預(yù)先處理好的PVDF膜上；PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；封閉結(jié)束后，用PBS洗膜3次，加入兔抗小鼠HMGB1抗體（1∶1 000稀釋），室溫孵育90 min；用PBST（內(nèi)含0.05%Tween-20）洗膜3次，每次10 min；加入羊抗兔IgG/HRP（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min；暗室內(nèi)加顯色底物顯色曝光并掃描成像。同時(shí)以β-Tubulin為內(nèi)參進(jìn)行校準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用Image J圖像分析軟件計(jì)算條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.7 肝腎功能檢測(cè) 造模12 h，各組取10只小鼠，通過(guò)取眼球法采血，離心并吸取上清液于干凈的EP管中，使用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）和血肌酐（CR）水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CD3+CD4+/CD3+CD8+比值 與Control組比較，IM組和ISM組的CD3+CD4+/CD3+CD8+明顯下降（P＜0.05），與ISM組相比，XT組CD3+CD4+/CD3+CD8+明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Fig.1 Comparison of CD3+CD4+/CD3+CD8+between four groups圖1 各組CD3+CD4+/CD3+CD8+的比較

2.2 血必凈干預(yù)后血細(xì)菌培養(yǎng)情況Control組和IM組小鼠血液中未檢出細(xì)菌，XT組與ISM組相比，細(xì)菌培養(yǎng)明顯減少［（246.75±61.15）CFUvs.（1 726.00±363.52）CFU，t=8.026，P＜0.01］。

2.3 各組IL-6、TNF-α水平變化 與Control組比較,ISM組和XT組釋放IL-6和TNF-α增多（P＜0.05）；與ISM組相比，XT組釋放IL-6和TNF-α減少（P＜0.05）；Control組與IM組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of IL-6 and TNF-α between four groups表1 各組IL-6、TNF-α的比較 （n=10，±s）

Tab.1 Comparison of IL-6 and TNF-α between four groups表1 各組IL-6、TNF-α的比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與ISM組比較，P＜0.05

組別Control組IM組ISM組XT組F IL-6(ng/L)68.98±4.70 65.39±3.93 87.85±5.08a 82.39±2.35ab 66.408＊＊TNF-α(ng/L)11.94±2.38 10.23±1.71 23.51±2.63a 20.30±1.74ab 88.944＊＊

2.4 各組HMGB1表達(dá)水平 與Control組比較，ISM組HMGB1表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與ISM組相比，XT組HMGB1表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）；Control組與IM組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

Fig.2 Comparison of HMGB1 between four groups圖2 各組HMGB1的比較

2.5 各組肝腎功能比較 與Control組比較，ISM組的ALT、AST、BUN、CR顯著升高（P＜0.05）；與ISM組比較，XT組ALT、AST、BUN、CR明顯降低（P＜0.05）；Control組與IM組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

3 討論

流行病學(xué)顯示嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克主要集中在老年患者，因膿毒癥死亡的人群中，65歲以上患者約占80%［8］。免疫低下和老年人膿毒癥高發(fā)息息相關(guān)，目前有很多膿毒癥的治療方法都在動(dòng)物研究轉(zhuǎn)化到臨床推進(jìn)中失敗［9-10］。動(dòng)物模型不能完全模仿臨床患者是重要因素之一。因此模擬免疫功能抑制的膿毒癥動(dòng)物模型制備研究，對(duì)膿毒癥新型治療方法的研發(fā)與評(píng)估，解決膿毒癥免疫調(diào)節(jié)治療方法的爭(zhēng)論具有重要意義。

Tab.2 Comparison of ALT,AST,BUN and CR between four groups表2 各組ALT、AST、BUN、CR的比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of ALT,AST,BUN and CR between four groups表2 各組ALT、AST、BUN、CR的比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較；b與ISM組比較，P＜0.05

組別Control組IM組ISM組XT組F ALT（U/L）43.27±3.58 41.99±2.55 269.67±8.38a 248.49±11.52b 2 870.779＊＊AST（U/L）133.29±5.37 133.46±4.31 326.61±21.91a 305.62±10.03b 713.324＊＊BUN（mmol/L）8.24±0.69 7.93±0.53 37.63±2.40a 34.54±2.57b 801.309＊＊CR（μmol/L）15.38±2.14 15.04±1.17 43.46±3.54a 40.28±2.06b 420.440＊＊

環(huán)孢素A常作為免疫抑制模型制備的藥物［11］，已在人轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌模型等［12-13］研究中得到廣泛應(yīng)用，而有關(guān)免疫抑制膿毒癥模型制備方面的研究，目前鮮見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠通過(guò)腹腔注射環(huán)孢素A后，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值明顯低于對(duì)照組，抑制了小鼠免疫系統(tǒng)，成功模擬了膿毒癥發(fā)病前免疫抑制狀態(tài)，在此基礎(chǔ)上腹腔注射大腸桿菌后成功制備膿毒癥模型。本研究將免疫抑制這一膿毒癥發(fā)病關(guān)鍵因素考慮在內(nèi)而制備的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，更貼近臨床膿毒癥發(fā)病實(shí)際，在一定程度上減少了膿毒癥無(wú)效研究的發(fā)生，提高了基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化的效率［14］。

為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的評(píng)估效果，本研究選擇了目前臨床常用的藥物血必凈進(jìn)行干預(yù)研究，結(jié)果提示，ISM組的CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值低于對(duì)照組，出現(xiàn)明顯免疫抑制；與ISM組相比，經(jīng)血必凈干預(yù)后，XT組CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值升高，提示血必凈能夠調(diào)節(jié)免疫抑制；與ISM組相比，經(jīng)血必凈治療后，XT組血細(xì)菌培養(yǎng)數(shù)量明顯下降。血必凈注射液由赤芍、川芎、丹參、紅花、當(dāng)歸等組成，其化學(xué)成分中含有紅花黃色素A、川芎嗪、丹參素、阿魏酸、芍藥苷等21種化合物［15］，是具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、潰散毒邪功效的復(fù)方中藥制劑。本研究結(jié)果也表明其能夠調(diào)節(jié)免疫功能，對(duì)抗細(xì)菌，降低內(nèi)毒素水平。

本研究提示，與ISM組比較，經(jīng)血必凈治療后XT組TNF-α、IL-6、HMGB1釋放明顯減少，說(shuō)明血必凈能夠減少免疫抑制膿毒癥小鼠炎癥因子的分泌。與Control組比較，ISM組和XT組的小鼠AST、ALT、BUN、CR顯著升高，提示2組小鼠均出現(xiàn)了肝臟、腎臟的急性損傷。與ISM組相比，血必凈治療后的XT組肝腎損傷相對(duì)較輕。早期促炎因子IL-6，TNF-α導(dǎo)致膿毒癥是引發(fā)炎癥過(guò)程、氧化應(yīng)激和多器官損傷的關(guān)鍵介質(zhì)，晚期炎癥因子HMGB1是介導(dǎo)器官損傷一種重要的細(xì)胞因子，且能夠與炎癥細(xì)胞因子相互作用［16］。血必凈干預(yù)后，減少了HMGB1、IL-6、TNF-α的釋放，減少炎性滲出，改善微循環(huán)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，有效減少損傷因子對(duì)機(jī)體重要器官的損害［17-18］。上述結(jié)果提示血必凈對(duì)免疫低下膿毒癥模型的療效確切，能夠改善小鼠的預(yù)后，新型免疫抑制膿毒癥模型也表現(xiàn)出了貼近臨床的治療效果，同時(shí)為血必凈適用于老年膿毒癥患者提供了理論基礎(chǔ)。

目前膿毒癥的治療仍面臨無(wú)特異性診斷方法、靶向藥物缺乏、炎癥反應(yīng)、免疫損害、凝血功能紊亂等復(fù)雜問(wèn)題。免疫抑制新型膿毒癥動(dòng)物模型的深入研究可能會(huì)為探尋膿毒癥治療方法研究，提供新的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。