Synaptotagmin1在小鼠卵母細(xì)胞體外受精過(guò)程中的作用

朱秀蘭，徐麗清，阮建興，唐婷，劉風(fēng)華

在不孕癥不斷增多的背景下，越來(lái)越多夫婦需要通過(guò)輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）解決生育問(wèn)題，體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET）臨床妊娠率可高達(dá)60%～70%，但即使如此，仍有一定比例夫婦存在受精異常而導(dǎo)致不孕；隨著ART應(yīng)用的增多，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量、受精率等成為影響ART成功的主要因素。有研究顯示，在IVF-ET中受精率低下占IVF-ET受精總數(shù)的11.82%，其中受精完全失敗者占受精異常的47.37%［1］。Synaptotagmin1（Syt1）在神經(jīng)和分泌囊泡膜富集，主要參與神經(jīng)遞質(zhì)和內(nèi)分泌顆粒的胞吐過(guò)程［2］，但在生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域研究甚少。本課題組前期研究闡述了Syt1在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的作用，并探討了機(jī)制［3］。本研究擬在此基礎(chǔ)上分析Syt1在小鼠受精過(guò)程中的作用，為闡明正常的受精和胚胎發(fā)育過(guò)程及其調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，并對(duì)目前不孕癥高發(fā)人群利用IVF-ET技術(shù)生育健康后代提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4～6周齡ICR品系雌性小鼠和7～8周齡ICR品系雄性小鼠（北京維通利華有限公司，SPF級(jí)）。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗Syt1抗體（Abcam）；TMA-DPH探針（Molecular Probes）；FITC-LCA、M2/M16培養(yǎng)液及其他化學(xué)用品購(gòu)自Sigma公司。所用Morpholino（MO）購(gòu)自美國(guó)GENE TOOLS公司。激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM 510 META，德國(guó)蔡斯）；活細(xì)胞實(shí)時(shí)拍攝系統(tǒng)（Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX，Perkin Elmer，美國(guó)）。

1.3 生殖細(xì)胞的收集和培養(yǎng) 先注射5 IU的孕馬血清促性腺激素（PMSG）于ICR雌性小鼠，進(jìn)行雌鼠的超促排卵，46～48 h后注射5 IU的人絨毛膜促性腺激素（hCG），36 h后頸椎脫臼快速處死小鼠后取出卵巢和輸卵管。收集第2次減數(shù)分裂中期（MⅡ）成熟卵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至M16培養(yǎng)液中。頸椎脫臼法快速處死ICR品系雄性小鼠，剪開陰囊皮膚，把睪丸連同附睪提起，用眼科剪將附睪連同睪丸剪下，置于培養(yǎng)皿中。剪碎附睪，置于37℃、5%CO2，95%濕度培養(yǎng)箱30 min后收集精子。生殖細(xì)胞收集后用于體外受精、免疫熒光、Western blot和qRT-PCR、活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察等處理。

1.4 Morpholino、β5-tubulin-GFP和H2B-RFP mRNA注射及皮質(zhì)顆粒胞吐的動(dòng)態(tài)觀察MO是經(jīng)過(guò)修飾的人工合成反義寡核苷酸鏈小分子，與目的基因的mRNA或（和）DNA結(jié)合，特異性抑制基因的轉(zhuǎn)錄或（和）翻譯，可作為研究基因功能的小分子工具。Syt1-MO序列：5′-GACTGGCACTCAC?CATTTTTGGTTC-3′；對(duì)照MO序列：5′-CCTCTTACCTCAgT?TACAATTTATA-3′。用無(wú)核酸酶水稀釋，工作濃度為4 mmol/L。取MⅡ期卵母細(xì)胞，注射β5-tubulin-GFP mRNA（標(biāo)記紡錘體）和H2B-RFP mRNA（標(biāo)記染色體）的混和物。然后MⅡ卵母細(xì)胞在含2.5 μmol/L米力農(nóng)的M2培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。新鮮M2培養(yǎng)液中洗5遍后置于新鮮M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)，標(biāo)記TMA-DPH探針，同時(shí)Srcl2孤雌激活或者與精子進(jìn)行體外受精，然后放置于活細(xì)胞工作站并實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察其變化，具體操作參考文獻(xiàn)［3］。注射過(guò)程中卵母細(xì)胞均置于含有2.5 μmol/L米力農(nóng)的M2培養(yǎng)液中，30 min內(nèi)完成操作。

1.5 熒光定量PCR檢測(cè)Syt1 mRNA的表達(dá) 將Syt1-MO和對(duì)照MO注射后的小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞與精子體外受精后收集受精24 h內(nèi)的受精卵，Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。上機(jī)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min；95℃15 s，62℃60 s，40個(gè)循環(huán)，62℃收集熒光信號(hào)。同時(shí)給予內(nèi)參GAPDH同步處理。對(duì)比內(nèi)參后檢測(cè)Syt1在受精卵中的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western blot檢測(cè)Syt1蛋白的表達(dá) 將Syt1-MO和對(duì)照MO注射后的MⅡ卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，2組收集待檢測(cè)的受精12 h和24 h的受精卵約150～200個(gè)，加入等體積2×SDS loading buffer，置于沸水中5 min，冰上冷卻后瞬時(shí)離心，存于冰上。微量加樣器上樣，恒壓90 V電泳至樣品位于濃縮膠邊緣，改為恒壓120 V電泳2.5 h；4℃條件下恒流200 mA轉(zhuǎn)膜2.5 h將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；TBS清洗膜3次，每次10 min；膜轉(zhuǎn)至封閉液中室溫放置1.5 h；TBST清洗3次，每次10 min，膜轉(zhuǎn)移至封閉液稀釋的兔抗Syt1一抗（1∶1 000）中，4℃放置過(guò)夜，TBST清洗3次，每次10 min；膜轉(zhuǎn)移至封閉液稀釋的HRP標(biāo)記二抗（1∶2 500）中，37℃放置1 h，TBST清洗3次，每次10 min。將化學(xué)發(fā)光底物滴加于PVDF膜，顯色5 min。以Syt1蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的IOD值的比值，即相對(duì)IOD值表示Syt1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)受精卵皮質(zhì)顆粒的表達(dá) 將注射Syt1-MO后的MⅡ卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，對(duì)照組注射對(duì)照MO。2組分別收集受精后不同時(shí)期（6 h和8 h）受精卵，置于含4%多聚甲醛的緩沖液中室溫固定30 min，透膜20 min，封閉1 h，然后加入1∶100的FITC-LCA，放入4℃冰箱過(guò)夜。第2天采用含0.1%Tween 20和0.01%Triton X-100的PBS洗3次，每次5 min，之后采用PI標(biāo)記染色體8～15 min，PBS洗3次。最后移到載玻片上。采用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組共測(cè)50個(gè)細(xì)胞。

1.8 小鼠受精率分析 將Syt1-MO顯微注射于MⅡ期卵母細(xì)胞，降調(diào)Syt1的表達(dá)；對(duì)照組注射對(duì)照MO，2組分別與精子體外受精，統(tǒng)計(jì)2組受精原核的形成數(shù)量。分析Syt1降調(diào)后對(duì)小鼠受精率是否有影響。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本均數(shù)比較采用方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒胞吐的動(dòng)態(tài)過(guò)程 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)觀察顯示，皮質(zhì)顆粒胞吐發(fā)生前卵母細(xì)胞有一個(gè)體積增大的瞬間（圖1中59 min 24 s），且胞吐位置相對(duì)紡錘體和染色體位置無(wú)明確位點(diǎn)關(guān)系，但發(fā)現(xiàn)部分在卵母細(xì)胞極體的位置附近，見圖1。

2.2 Syt1在小鼠體外受精后不同時(shí)間受精卵中的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，小鼠受精后24 h內(nèi)的受精卵中Syt1的表達(dá)量逐漸增加，30 min表達(dá)量最低，之后逐漸增加，見圖2。

Fig.2 The relative expression levels of Syt1 in zygotes afer mouse fertilization in vitro圖2 Syt1在小鼠體外受精后不同時(shí)間受精卵中的表達(dá)情況

2.3 Syt1降調(diào)在受精卵中的定量表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，體外受精后12 h和24 h，Syt1-MO組受精卵中Syt1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，Morpholino顯著降調(diào)了Syt1蛋白表達(dá)，見圖3。

Fig.3 Western blot analysis of expression of Syt1 in zygotes for 12 h and 24 h圖3 免疫印跡分析Syt1在小鼠卵母細(xì)胞受精12 h和24 h受精卵中的表達(dá)

2.4 Syt1降調(diào)后受精卵中皮質(zhì)顆粒的表達(dá) 免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，Syt1-MO組小鼠卵母細(xì)胞受精后6 h和8 h受精卵中皮質(zhì)顆粒的表達(dá)較對(duì)照組中增加，見圖4。

2.5 Syt1降調(diào)對(duì)小鼠受精率的影響 結(jié)果顯示，Syt1-MO降調(diào)后小鼠受精率（12.00%±0.43%）較對(duì)照組（53.80%±3.34%）顯著降低（n=3，t=50.215，P＜0.001）。

3 討論

3.1 Syt1用于卵母細(xì)胞受精及受精障礙研究的理論依據(jù) 卵母細(xì)胞受精是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程［4］。精子獲能、穿過(guò)卵丘、透明帶結(jié)合與識(shí)別、頂體反應(yīng)、精卵結(jié)合與融合、卵子活化以及原核形成及融合等，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題都可能導(dǎo)致受精失敗，其中既有卵子因素又有精子因素。Satouh等［5］觀察到精子與卵子融合瞬間和頂體反應(yīng)蛋白IZUMO1的動(dòng)態(tài)定位過(guò)程。Huang等［6］首次報(bào)道了人類卵子透明帶缺失病例，ZP1基因缺陷影響了卵細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中透明帶的形成，導(dǎo)致精子無(wú)法與卵子正常結(jié)合，使患者最終失去生育能力。相對(duì)于受精過(guò)程的經(jīng)典理論，如頂體完整的獲能精子與卵子透明帶ZP3識(shí)別，發(fā)生頂體反應(yīng)并完成受精。隨著研究深入，受精理論也隨之更新，如ZP2也參與人精子與透明帶結(jié)合與識(shí)別［7-8］，卵丘細(xì)胞中發(fā)生頂體反應(yīng)的精子可穿過(guò)透明帶，完成受精［9］，卵周隙中已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子同樣具有再次受精的能力［10]。因此，本研究對(duì)闡述正常受精、確定Syt1是否為受精障礙的靶標(biāo)基因或因子以及為臨床IVF-ET受精障礙患者治療方案提供理論指導(dǎo)。

3.2 Morpholino方法在生殖領(lǐng)域的應(yīng)用Morpholino是經(jīng)過(guò)修飾的人工合成反義寡核苷酸鏈小分子，與目的基因的mRNA或（和）DNA結(jié)合，特異性抑制基因的轉(zhuǎn)錄或（和）翻譯，從而降調(diào)目的基因的表達(dá)。相比于RNAi等其他反義干擾技術(shù)，MO不會(huì)被酶所降解，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性極強(qiáng)，而且對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用，因此作為基因功能的研究工具而廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究中。Zhang等［11］通過(guò)顯微注射MO降調(diào)CenpH的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CenpH可通過(guò)APC/CCdh1-cyclin B1通路調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中細(xì)胞的G2/M轉(zhuǎn)變。Kaufman等［12］用此方法研究了斑馬魚生殖細(xì)胞的母源性調(diào)節(jié)。MO降調(diào)Mf152表達(dá)后引起斑馬魚胚胎的發(fā)育異常［13］。鑒于此，本研究同樣采用Morpholino顯微注射小鼠卵母細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其顯著降調(diào)了Syt1基因的表達(dá)。

3.3 Syt1用于小鼠受精功能研究的理論依據(jù)Syt1是神經(jīng)突觸囊泡蛋白，與神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞中鈣離子結(jié)合，促使神經(jīng)遞質(zhì)和內(nèi)分泌細(xì)胞顆粒釋放，從而引起相應(yīng)的生物學(xué)行為甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生［14-15］。目前Syt1在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的研究更完善，但是在生殖領(lǐng)域研究甚少。前期研究發(fā)現(xiàn)Syt1與卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒共定位［3］。卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒在受精或孤雌激活時(shí)發(fā)生的皮質(zhì)反應(yīng)也是基于鈣離子調(diào)控機(jī)制。在生殖醫(yī)學(xué)臨床工作中，隨著ART技術(shù)的廣泛應(yīng)用，受精異常患者也趨于增多。受精正常和受精異常組患者的年齡、不孕年限、促排卵方案、獲卵數(shù)、卵成熟比例相似；受精異常組原發(fā)不孕癥比例明顯增高，伴有男性因素及不明原因患者受精異常率高［1，16］。所以在高齡、高激素水平、原發(fā)不孕、不明原因不孕和伴有男方輕中度少、弱、畸形精子癥的患者在行IVF-ET助孕時(shí)可能存在受精失敗。本研究結(jié)果顯示Syt1在小鼠受精卵中的表達(dá)逐漸增加，Syt1降調(diào)后影響了受精卵中的皮質(zhì)顆粒表達(dá)及分布，并降低了小鼠的受精率，由此證實(shí)Syt1直接參與了小鼠的受精過(guò)程，為進(jìn)一步了解Syt1對(duì)不孕癥受精失敗人群是否發(fā)揮作用提供指導(dǎo)。

總之，本研究用活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察了小鼠受精時(shí)皮質(zhì)顆粒胞吐的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，并證實(shí)了Syt1直接參與了小鼠受精過(guò)程，所以推測(cè)Syt1有可能作為臨床受精障礙的靶標(biāo)分子，也為進(jìn)一步了解正常受精過(guò)程及IVF-ET中受精障礙患者提供了理論指導(dǎo)。但是Syt1影響受精過(guò)程的具體機(jī)制以及在臨床中進(jìn)一步的應(yīng)用仍然需要深入研究。

Fig.1 The dynamic process of CGs exocytosis圖1 小鼠皮質(zhì)顆粒胞吐的動(dòng)態(tài)變化

Fig.4 CGs expression and distribution changes in zygotes after down-regulation of Syt1圖4 Syt1降調(diào)影響小鼠卵母細(xì)胞受精后皮質(zhì)顆粒的表達(dá)