雙特異性磷酸酶2對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制研究

劉師偉，李輝，張奇雪，蔣昭，趙秀娟，吳云丹

胃癌作為世界上第五大常見(jiàn)癌癥，其在惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡中占第三位［1］。盡管聯(lián)合手術(shù)、放療和化療多種治療手段，目前胃癌患者的預(yù)后仍然很差，5年的總體生存率小于25%［2］。目前對(duì)于各種腫瘤包括胃癌的精準(zhǔn)治療十分熱門，理解其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并依此尋找安全高效的基因治療方法變得日趨緊迫。

雙特異性磷酸酶（DUSP）屬于酪氨酸特異性磷酸酶家族的經(jīng)典成員，其功能除涉及生物體內(nèi)多種基本的生理活動(dòng)，如增殖調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］。目前已發(fā)現(xiàn)經(jīng)典及非經(jīng)典的DUSP成員達(dá)30余種，其中DUSP2（又稱PAC-1）已被證實(shí)不僅是免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)者［4］，而且在多種腫瘤，如前列腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤及白血病等中呈低表達(dá)，并且通過(guò)多種信號(hào)通路參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］。有文獻(xiàn)報(bào)道，DUSP2在體外可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和P38的活性［6］，但DUSP2在胃癌中的作用及機(jī)制目前尚未明確。為此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了DUSP2過(guò)表達(dá)的慢病毒載體，并進(jìn)一步篩選鑒定DUSP2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的MKN-45胃癌細(xì)胞株，進(jìn)而探討上調(diào)的DUSP2對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人源腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞、胃癌細(xì)胞系（MKN-45、SGC-7901、HGC-27、N-87）及正常的胃上皮細(xì)胞系GES-1（江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；Trans-5a感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；pLVX-EF1a-IRES-puro載體、psPAX2、pMD2.G包裝質(zhì)粒（上海滬震生物有限公司）；Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司）；RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、雙抗（美國(guó)Hyclone公司）；嘌呤霉素（Puromycin）（美國(guó)Sigma公司）；RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒、Fast DigestXbalⅠ、NotⅠ內(nèi)切酶（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Fast SYBR Green Master Mix（德國(guó)Roche公司）；無(wú)內(nèi)毒素高純質(zhì)粒中量提取試劑盒（離心柱型）（美國(guó)Biomiga公司）；RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；FLAG、ERK、p-ERK（Thr202/Tyr204）、P38、p-P38蛋白抗體（美國(guó)CST公司）；羊抗兔、兔抗鼠二抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Millipore公司）。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；電泳槽、電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司。引物合成及測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 胃癌患者預(yù)后價(jià)值評(píng)估 首先，通過(guò)公共的在線分析工具KM plotter（http://kmplot.com）評(píng)估DUSP2的表達(dá)對(duì)胃癌患者的預(yù)后價(jià)值。該分析工具整合了6個(gè)提交在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的胃癌患者基因芯片結(jié)果，排除缺失數(shù)據(jù)后將876例樣本納入統(tǒng)計(jì)范圍，依據(jù)DUSP2mRNA表達(dá)水平繪制Kaplan-Meier生存曲線，比較DUSP2表達(dá)高低患者生存率的差異。。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DUSP2mRNA表達(dá)量 胃癌細(xì)胞株MKN-45、SGC-7901、HGC-27、N-87及正常的胃上皮細(xì)胞系GES-1均為貼壁生長(zhǎng)，采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（10%FBS+1%雙抗）置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱飽和濕度下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5種細(xì)胞，采用Trizol法抽提總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：42℃60 min；95℃5 min；4℃5 min。以上述5種細(xì)胞的cDNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)管家基因β-actin（內(nèi)參）和DUSP2mRNA的表達(dá)水平。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。引物序列：DUSP2引物上游5′-TGCCCCAACCACTTTGAGG-3′；下游5′-AGTCAATGAAGC CTATGGCCT-3′；β-actin引物上游5′-ATTGCCGACAGGAT GCAGA-3′；下游5′-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′。最后采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法進(jìn)行分析。

1.2.3 重組真核慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLVX-DUSP2-FLAG的構(gòu)建 （1）DUSP2-FLAG融合片段的擴(kuò)增：以pCDNA3.1-DUSP2-FLAG質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增DUSP2-FLAG融合基因片段。（2）pLVX載體線性化：使用快速限制性內(nèi)切酶XbalⅠ、NotⅠ線性化pLVX-EF1a-IRES-puro質(zhì)粒載體，同時(shí)切膠回收雙酶切PCR產(chǎn)物。（3）DUSP2-FLAG PCR產(chǎn)物與pLVXEF1a-IRES-puro線性載體連接：pLVX-EF1a-IRES-puro載體和PCR產(chǎn)物連接比例為1∶3，16℃反應(yīng)過(guò)夜。（4）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化Trans-5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆搖菌，使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，將提取的pLVX-DUSP2-FLAG質(zhì)粒用Fast DigestXbalⅠ、NotⅠ雙酶切，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定，然后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 DUSP2過(guò)表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建 用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000包裹慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)（pLVX-DUSP2-FLAG/pLVX control、pMD2.G、psPAX2）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝；48～72 h后大量病毒產(chǎn)生，收集含病毒的培養(yǎng)液，經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾。將含有pLVX-DUSP2-FLAG和pLVX control的病毒液分別加入已預(yù)先鋪好MKN-45細(xì)胞的6孔板內(nèi)，48 h后換液，加入含嘌呤霉素的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選（2 mg/L），培養(yǎng)36 h，觀察細(xì)胞狀態(tài)，逐漸降低藥物濃度，最終維持在1 mg/L。選取穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞分組：實(shí)驗(yàn)組為DUSP2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的胃癌MKN-45細(xì)胞，對(duì)照組為空載慢病毒轉(zhuǎn)染并篩選后的胃癌MKN-45細(xì)胞。

1.3 MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 分別計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞數(shù)，按每孔500個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，向培養(yǎng)板中每孔加入20 μL MTS試劑，5%CO2、37℃孵箱中靜置1 h后使用Biotek酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣本490 nm處的光密度（OD）值，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取3×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μL Binding Buffer懸浮，然后各加5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide混勻；室溫避光15 min后上機(jī)檢測(cè)：Q1區(qū)呈AnnexinⅤ-FITC陽(yáng)性、PI陰性，為早期凋亡細(xì)胞；Q2區(qū)呈AnnexinⅤ-FITC陽(yáng)性、PI陽(yáng)性，為晚期凋亡細(xì)胞；Q3區(qū)呈AnnexinⅤ-FITC陰性、PI陽(yáng)性，為機(jī)械性損傷細(xì)胞；Q4區(qū)呈AnnexinⅤ-FITC陰性、PI陰性，為活細(xì)胞。每組樣品重復(fù)3次，取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DUSP2mRNA表達(dá)量 采用Trizol法抽提實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體步驟及結(jié)果分析同1.2.2。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量 提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取35～40 μg總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉；加入一抗孵育過(guò)夜（按體積比1∶1 000稀釋）；洗滌后加入二抗，孵育2 h（按體積比1∶5 000稀釋）；充分洗滌后用電化學(xué)發(fā)光法曝光檢測(cè)標(biāo)本膜上的信號(hào)，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t法，兩個(gè)樣本的組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，2組患者生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DUSP2表達(dá)與胃癌患者預(yù)后分析Kaplan–Meier分析表明DUSP2高表達(dá)的胃癌患者的生存率明顯優(yōu)于低表達(dá)患者（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DUSP2mRNA表達(dá)量 結(jié)果表明，DUSP2mRNA表達(dá)在對(duì)照及多種胃癌細(xì)胞中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 DUSP2過(guò)表達(dá)慢病毒載體的鑒定及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系的建立pLVX-DUSP2-FLAG質(zhì)粒依次經(jīng)菌落篩選、陽(yáng)性菌落擴(kuò)增、提取質(zhì)粒、XbalⅠ、NotⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的完整性和排除重組，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。最后進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中人DUSP2基因序列完全相符。Western blot檢測(cè)FLAG的表達(dá)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組胃癌MKN-45細(xì)胞中可檢測(cè)到FLAG蛋白表達(dá)（圖3A），同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的DUSP2mRNA水平較對(duì)照組明顯增高（n=3，t=19.365，P＜0.01），見(jiàn)圖3B。證實(shí)實(shí)驗(yàn)組DUSP2過(guò)表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建成功。

Fig.1 Kaplan-Meier survival curves of gastric cancer patients with different expression levels of DUSP2圖1 DUSP2不同表達(dá)水平胃癌患者的生存曲線

Fig.2 The expressions of DUSP2 in gastric cancer cell lines圖2 DUSP2在不同胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

Fig.3 The validation of DUSP2 overexpression stable cell line圖3 DUSP2過(guò)表達(dá)穩(wěn)定株的鑒定

2.4 DUSP2過(guò)表達(dá)抑制胃癌MKN-45細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別在24、48、72和96 h增殖能力均受到明顯抑制（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。進(jìn)一步用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組細(xì)胞（n=3，t=4.325，P＜0.05），見(jiàn)圖5。

Fig.4 The effect of DUSP2 overexpression on MKN-45 cell proliferation圖4 DUSP2過(guò)表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖的影響

Fig.5 The effect of DUSP2 overexpression on MKN-45 cell apoptosis圖5 DUSP2過(guò)表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞凋亡的影響

2.5 DUSP2過(guò)表達(dá)抑制ERK、P38磷酸化Western blot結(jié)果顯示，分別以總ERK、P38表達(dá)水平為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組ERK、P38的磷酸化水平較對(duì)照組均顯著降低（n=3，t分別為16.393、7.936，P＜0.01），見(jiàn)圖6。

Fig.6 The effect of DUSP2 overexpression on phosphorylation of MAPK pathway圖6 DUSP2過(guò)表達(dá)對(duì)MAPK通路磷酸化水平的影響

3 討論

3.1 胃癌的臨床治療現(xiàn)狀 胃癌的治療主要以手術(shù)治療為主，其他綜合治療為輔。進(jìn)展期胃癌患者約68%發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，常規(guī)治療后5年生存率約為30%左右［7-8］。早期胃癌患者通過(guò)外科手術(shù)治療效果相對(duì)理想，其5年生存率可以達(dá)到85%～95%［9］。但早期胃癌無(wú)明顯癥狀，大部分發(fā)現(xiàn)者已處于胃癌晚期，治愈較為困難。目前胃癌的傳統(tǒng)治療已不能滿足臨床患者的需求，亟需探索開(kāi)發(fā)新的治療方法。近十年來(lái)關(guān)于腫瘤基因療法的研究已逐漸深入，研究胃癌不同發(fā)展階段的基因表達(dá)變化，可更好地幫助人們從分子層面了解胃癌的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而為胃癌基因診斷和治療提供重要的理論依據(jù)。

3.2DUSP2基因的研究意義DUSP2又名PAC-1，是一種調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡的核特異性磷酸酶，其通過(guò)去磷酸化底物中絲氨酸或者蘇氨酸殘基從而使其失活［10］。最初研究發(fā)現(xiàn)其廣泛表達(dá)于淋巴組織，參與免疫調(diào)節(jié)等生理過(guò)程［11］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，DUSP2與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如在卵巢癌中，DUSP2高表達(dá)預(yù)示了更低的總體生存率［12］。而在急性白血病患者中，DUSP2的損失和持續(xù)的ERK激活密切相關(guān)，表明DUSP2可能起著抑癌基因的角色［13］。關(guān)于DUSP2在胃癌中的作用及相關(guān)分子機(jī)制目前鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，胃癌患者中DUSP2低表達(dá)預(yù)示生存率較差。在胃癌細(xì)胞中，通過(guò)MTS細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DUSP2的過(guò)表達(dá)使胃癌細(xì)胞的增殖能力顯著下降，而相對(duì)應(yīng)的凋亡率增加，說(shuō)明DUSP2表達(dá)上調(diào)可有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖。此外，Western blot結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路的重要介導(dǎo)者ERK和P38的磷酸化水平降低，說(shuō)明DUSP2通過(guò)調(diào)控MAPK通路來(lái)發(fā)揮作用。上述結(jié)果驗(yàn)證了DUSP2基因很可能作為抑癌基因之一，在胃癌的增殖、分化、侵襲過(guò)程中起到關(guān)鍵性的作用。

3.3 MAPK家族與腫瘤 眾所周知，MAPK是一類經(jīng)典的廣泛調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等一系列生理過(guò)程的激酶家族的統(tǒng)稱［14］。哺乳動(dòng)物MAPK家族主要分3類：ERK、P38絲裂原活化蛋白激酶和C-Jun N末端激酶（JNK）［15］。目前，關(guān)于ERK信號(hào)通路在腫瘤中的作用主要體現(xiàn)在促細(xì)胞增殖方面，而JNK和P38除了參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，還介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［16］。研究表明，在胃癌發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，ERK信號(hào)通路常被激活，而且P38通路的激活也與胃癌的形成有關(guān)［17］。DUSP2作為MAPK磷酸酶家族的重要一員，是公認(rèn)的MAPK家族的主要負(fù)性調(diào)控者。本研究中，DUSP2的上調(diào)表達(dá)使胃癌細(xì)胞中ERK和P38的磷酸化水平明顯降低，具體的調(diào)控機(jī)制仍需深入研究。

綜上所述，DUSP2在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，該基因可能作為胃癌的抑癌基因和預(yù)后基因，為胃癌的臨床診斷和治療提供指導(dǎo)。