甘草與復(fù)方五倍子對黃河鯉非特異性免疫力影響的研究

文/韓永峰 吳 桃 賈振榮 薛樹平 張麗霞

將復(fù)方五倍子和甘草添加到飼料中投喂體重為60g左右的黃河鯉魚，設(shè)5個試驗組（復(fù)方五倍子組、甘草組、空白組、陽性/陰性對照組）。結(jié)果表明，試驗期第12天（即投喂藥餌后第4天），甘草組的黃河鯉魚器官免疫指數(shù)分別為腎臟0.37±0.02，脾臟0.66±0.02，顯著高于陽性對照組。試驗期的第12天、16天、20天，堿性磷酸酶活性、溶菌酶活性明顯高于陽性對照組。因此，藥餌中的復(fù)方中藥對試驗鯉魚機(jī)體免疫器官指數(shù)的提高，以及具有免疫功能溶菌酶、堿性磷酸酶活性的增強(qiáng)有一定的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，使用添加甘草酸的飼料投喂鰣魚4周后，以半致死劑量的鏈球菌攻毒，魚存活率與甘草酸的投喂量成正相關(guān)。不僅如此，甘草對魚還有調(diào)節(jié)免疫、抑和滅活病毒、降低轉(zhuǎn)氨酶以及改善肝組織損傷的作用。復(fù)方五倍子口服液對魚類的細(xì)菌性疾病防治有較好效果。因此本試驗嘗試在投喂黃河鯉魚的飼料中添加甘草與復(fù)方五倍子。經(jīng)檢測外周的溶菌酶活性與磷酸酶活性來研究兩種藥物對黃河鯉魚的非特異性免疫功能影響，為研究復(fù)方中藥在提高魚類機(jī)體免疫力等方面提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

一、材料和方法

（一）材料

1.試驗魚類

黃河鯉魚購于達(dá)拉特旗大樹灣漁業(yè)協(xié)會，共300尾，體重60g左右，體長12cm左右， 經(jīng)4%食鹽水消毒后分池暫養(yǎng)1周。

2.復(fù)方中藥的來源及配比

甘草、五倍子、大黃和黃芩主要購于達(dá)拉特旗中心醫(yī)院中藥房，藥餌的主要成分為五倍子、大黃、甘草，并以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、25%、25%的比例混合配制成復(fù)方中藥（下文稱復(fù)方五倍子），再將甘草、復(fù)方五倍子粉碎后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%和70%混合，最后以2.0%的添加量加入飼料中，混合均勻后制成2.00mm粒徑的飼料（下文稱藥餌）。

3.飼料

購自天津市某飼料有限責(zé)任公司（蛋白質(zhì)含量為28%）。

（二）方法

1.試驗分組及飼養(yǎng)

試驗在鄂爾多斯市農(nóng)畜產(chǎn)品檢測中心試驗室進(jìn)行。選擇健壯無病的黃河鯉魚設(shè)5個試驗組，同時每組設(shè)有1個平行組：復(fù)方五倍子組、甘草組、空白組、陽性/陰性對照組共10個水族箱，每組飼養(yǎng)60尾黃河鯉魚。

整個試驗周期為20d，試驗期的第8d第1次取樣，第8d開始投喂藥餌，第12d進(jìn)行第2次取樣，第13d進(jìn)行攻毒試驗，第16d進(jìn)行第3次取樣，第20d進(jìn)行第4次取樣。在攻毒后的第4d（試驗期的第16d）和第8d（試驗期的第20d）測試黃河鯉魚的各項免疫指標(biāo)。嗜水氣單胞菌0.1mL注射于黃河鯉魚體內(nèi)進(jìn)行攻毒，空白組、陰性對照組用生理鹽水（0.86%）替代。攻毒后觀察記錄各組黃河鯉魚的癥狀及死亡數(shù)量。然后用統(tǒng)計處理軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值（X±SD）表示，并進(jìn)行Duncan’s法比較。

2.嗜水氣單胞菌劑

菌液制備：接種于液體培養(yǎng)基中，在28℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，麥?zhǔn)媳葷岱ù_定濃度，用鹽水稀釋制備成含菌量1.5×108個/mL的菌液。

3.堿性磷酸酶與溶菌酶的測定

溶菌酶的含量（μg/mL）=[（測定管透光度－對照管透光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管透光度－空白管透光度）] ×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（10μg/mL）×樣本測試前稀釋倍數(shù)

堿性磷酸酶（金氏單位/100mL）=[（測定管透光度－對照管透光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管透光度－空白管透光度）]×100mL×0.05mL

貯備液的配制：取1支（5mg/支）的菌粉，加1mL菌粉溶劑，旋轉(zhuǎn)研磨3分鐘后置2℃～8℃冰箱封閉保存1周。

4.采血

在魚體的尾靜脈取血，血液先在室溫下靜置1h待凝固，于4℃下以4000r/min離心25min，收集上層血清4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、試驗結(jié)果

（一）攻毒對黃河鯉魚死亡率的影響

攻毒后（試驗期第13天），各試驗組死亡率最高及時間節(jié)點(diǎn)：陽性對照組24h后為12%，甘草組48h后為53%，陽性對照組72h后為 68%。甘草組的死亡率相較于陽性對照組和復(fù)方五倍子組明顯下降，結(jié)果顯示，添加甘草和復(fù)方五倍子的藥餌可以明顯減少黃河鯉魚的患病數(shù)量，降低死亡率，對嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥起到了較好的預(yù)防與治療。

（二）免疫器官指數(shù)的變化

經(jīng)統(tǒng)計分析表明（試驗結(jié)果見表1），第一次取樣（試驗期第8天）的肝胰臟指數(shù)空白組、陽性對照組陰性對照組、復(fù)方五倍子組和甘草組之間并沒有顯著差異（P＞0.05）；第二次取樣（試驗期第12天，也是投喂藥餌后的第4天），即攻毒前1天測定空白組與復(fù)方五倍子組的肝胰臟差異顯著（P＜0.05），對照組脾臟分別與陰性對照組、復(fù)方五倍子組和甘草組差異極顯著（P＜0.01），腎臟各組沒有顯著差異；攻毒后的第4天（試驗期的第16天）測定陽性對照組肝胰臟和甘草組差異極顯著（P＜0.01），腎臟無顯著差異，脾臟也無顯著差異；攻毒后第8天（試驗期的第20天），經(jīng)統(tǒng)計分析表明，對照組的肝胰臟與甘草組差異極顯著，腎臟無顯著差異，但是對照組脾臟與甘草組有顯著差異。

表1 免疫器官指數(shù)的變化規(guī)律

（三）對黃河鯉魚的堿性磷酸酶活性的影響

在試驗期第16天時甘草組的堿性磷酸酶活性顯著高于空白組、陽性對照組和復(fù)方五倍子組。試驗期第12天時甘草組的AKP酶活性有上升趨勢，到試驗期第16天達(dá)到高峰后開始下降。

（四）溶菌酶對黃河鯉魚非特異性免疫的影響

試驗結(jié)果表明，試驗期第12天甘草組的溶菌酶活性顯著高于其他各組。陽性對照組相較于復(fù)方五倍子組的溶菌酶的活性要稍微高一些，甘草組在試驗期第12天溶菌酶活性最大。

三、分析與討論

（一）攻毒后黃河鯉魚的死亡率

試驗黃河鯉魚在攻毒2h后出現(xiàn)死亡，死亡高峰期在48h，病魚癥狀呈典型的細(xì)菌性敗血癥癥狀，表明病魚因嗜水氣單胞菌致死。添加甘草的復(fù)方五倍子藥餌可以明顯降低黃河鯉魚的患病數(shù)量和死亡率，對嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥起到較好的預(yù)防與治療。

（二）對黃河鯉魚免疫器官指數(shù)的影響

魚的主要免疫器官為脾臟、腎臟和肝胰臟，而脾臟是魚類機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官，是產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞和抗體的場所之一。試驗結(jié)果表明，空白組與陰性對照組、陽性對照組和甘草組相較脾臟指數(shù)極顯著（P<0.01），陽性對照組的脾臟指數(shù)相較于陰性對照組、復(fù)方五倍子性組和甘草組極顯著（P<0.01）。空白組和甘草組的腎臟指數(shù)差異顯著（P<0.05），陰性、陽性對照組差異顯著（P<0.05），陰性對照組、甘草組差異極顯著（P<0.01）。魚類的肝胰臟是重要的解毒器官，也是重金屬蓄積的主要部位，有防御免疫能力，試驗中也將肝臟指數(shù)作為檢驗指標(biāo)之一。如表1陽性對照組相較于陰性對照組、復(fù)方五倍子組和甘草組肝臟的指數(shù)極顯著（P<0.01），甘草組與其他各組無顯著差異。

（三）對黃河鯉魚堿性磷酸酶的影響

堿性磷酸酶是一種非特異性的磷酸水解酶，在生物體內(nèi)的磷代謝過程中起著十分重要的作用，可催化磷酸單脂的水解及磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在調(diào)節(jié)魚類體內(nèi)鈣磷吸收，維持鈣磷平衡方面有著重要作用，對于水生動物來講是重要調(diào)控酶類之一。目前我國學(xué)者已對多種貝類的AKP進(jìn)行了研究，就貝類而言AKP不僅維持體內(nèi)鈣磷比例，而且還與貝類角蛋白的分泌相關(guān)，同時也作為溶酶體酶的重要組成部分，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮極其重要的作用。試驗中研究表明，復(fù)方中藥可以提高黃河鯉魚AKP酶的活性，黃河鯉魚的AKP酶同樣在攻毒后開始呈現(xiàn)下降趨勢。

（四）對黃河鯉魚溶菌酶活性的影響

溶菌酶是魚類血液中極為重要的一種非特異性免疫因素，居于非特異性免疫的第一道屏障，主要針對于革蘭氏陽性菌發(fā)揮溶菌作用，其活性的高低直接反映出溶菌作用的強(qiáng)弱，是吞噬細(xì)胞對所吞噬的病原菌能否殺滅的物質(zhì)基礎(chǔ)，動物體內(nèi)許多組織和體液中都含有溶菌酶，血清中的溶菌酶主要來自血細(xì)胞中，是一種堿性蛋白，能水解細(xì)菌的細(xì)胞壁中粘肽的乙酰氨基多糖并使之裂解被釋放出來，形成一個水解酶體系從而破壞和消除侵人體內(nèi)的異物，實現(xiàn)其機(jī)體防御的功能。測定魚類的溶菌酶活性，可以在一定程度上反映魚類非特異性體液免疫狀態(tài)。動物血清中的溶菌酶的活性可以因機(jī)體接觸抗原性物質(zhì)或者免疫刺激劑而上升。趙明森認(rèn)為，使用微生態(tài)活菌制劑后，4d～5d開始發(fā)揮作用，7d～10d效果最好。草魚體表溶菌酶活性受飼養(yǎng)溫度的影響，在10℃下飼養(yǎng)時，溶菌酶活性較低；而28℃下飼養(yǎng)時，溶菌酶活性要高得多。本研究表明在復(fù)方五倍子中添加甘草在一定程度上可以提高黃河鯉魚的溶菌酶的活性。而在攻毒后第8天黃河鯉魚的溶菌酶活性下降，可能是魚在感染病毒后，由于其自身的體質(zhì)下降，導(dǎo)致其溶菌酶活性降低。

試驗結(jié)果表明，腎臟、肝臟、肝胰臟的免疫力和抗病力都明顯增強(qiáng)；同時溶菌酶和堿性磷酸酶的活性也明顯提高。因此，中藥復(fù)方能夠增強(qiáng)黃河鯉魚的免疫能力，可以降低各種病毒病和細(xì)菌病的發(fā)病率，從而可以給生產(chǎn)增添一種病毒病和細(xì)菌病疾病預(yù)防方法。