疫苗及其在水生動(dòng)物疾病預(yù)防中的應(yīng)用（三）

文/王玉堂

上接2018年8期

三、我國(guó)水產(chǎn)疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的應(yīng)用前景

首先需要說(shuō)明的是，魚類具有較健全的免疫器官和組織，也具有一系列的免疫細(xì)胞，這些都是對(duì)魚類實(shí)施免疫預(yù)防各種疾病的基礎(chǔ)。魚類免疫器官和組織主要有胸腺、腎臟和黏膜淋巴組織等，這些是魚類最主要的免疫器官和組織；其次還有參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的，統(tǒng)稱為免疫細(xì)胞。魚類的免疫細(xì)胞還可分為兩大類，即淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞。淋巴細(xì)胞主要參與特異性免疫應(yīng)答，在免疫應(yīng)答中起核心作用。免疫細(xì)胞主要存在于免疫器官、組織及血液和淋巴中。全世界已有100多種魚用疫苗的商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用，說(shuō)明利用疫苗進(jìn)行魚類的疾病預(yù)防具有廣泛的市場(chǎng)。

我國(guó)養(yǎng)殖的魚類種類很多，而且一些常規(guī)養(yǎng)殖品種年產(chǎn)量巨大，一旦相應(yīng)的魚用疫苗開發(fā)成功，其應(yīng)用市場(chǎng)也是非常巨大的。魚用疫苗的開發(fā)與應(yīng)用，可有效預(yù)防細(xì)胞性疾病，減少抗生素類藥物用量，既能有效降低用藥成本，又能解決藥物殘留帶來(lái)的水產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題，還可降低水產(chǎn)品消費(fèi)者通過(guò)食物鏈而產(chǎn)生的耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。

隨著漁業(yè)形勢(shì)的變化和人們對(duì)食品質(zhì)量的需求，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部先后出臺(tái)了無(wú)公害水產(chǎn)品養(yǎng)殖規(guī)范、禁用漁藥物清單等系列與水產(chǎn)品安全相關(guān)的文件。疫苗可使魚類高特異抵御病原的攻擊，而我國(guó)海、淡水養(yǎng)殖魚類中，因細(xì)菌、病毒和寄生蟲等所致病害而造成的損失占養(yǎng)殖病害總損失的80%以上，因此，疫苗的開發(fā)與應(yīng)用意義極為重大。用水產(chǎn)動(dòng)物疫苗等免疫制劑替代危害性大的化學(xué)藥品已勢(shì)在必行，免疫制劑這類綠色、環(huán)保產(chǎn)品在3年～5年后成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)抗病的明星產(chǎn)品大有希望。

（一）消除水產(chǎn)品藥物殘留隱患急需水產(chǎn)疫苗的開發(fā)

長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)水產(chǎn)疫病的控制主要依靠使用各種抗生素和化學(xué)藥物，但大量使用藥物的后果令人擔(dān)憂，已嚴(yán)重危及環(huán)境和人體健康。目前，生產(chǎn)上使用的漁藥大部分由獸藥、農(nóng)藥移植而來(lái)，缺乏對(duì)藥效學(xué)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)及對(duì)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的影響等基礎(chǔ)理論的研究；藥物的臨床驗(yàn)證工作未受到足夠的重視，藥物的給藥劑量、用藥程序、休藥期缺乏科學(xué)依據(jù)，導(dǎo)致濫用、錯(cuò)用漁藥的情況十分普遍。此外我國(guó)缺乏快速、簡(jiǎn)便的實(shí)用性診斷技術(shù)，難以做到對(duì)癥下藥或?qū)σ蚴┧?，盲目用藥現(xiàn)象極為嚴(yán)重。長(zhǎng)期濫用藥物違背人們所倡導(dǎo)的健康養(yǎng)殖宗旨，不僅藥物的使用效果受到了限制，延誤治病，造成水產(chǎn)品大量死亡和藥物浪費(fèi)的雙重?fù)p失；還可誘發(fā)細(xì)菌基因突變或轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致無(wú)藥可用；更嚴(yán)重的是藥物在養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)殘留會(huì)污染養(yǎng)殖環(huán)境。我國(guó)由于水產(chǎn)品藥物殘留量超標(biāo)導(dǎo)致出口受阻的教訓(xùn)極為慘重，養(yǎng)殖業(yè)賴于持續(xù)發(fā)展的某些生態(tài)資源枯竭化。隨著對(duì)抗菌素等藥物的使用安全性日益重視，人們對(duì)安全性的認(rèn)識(shí)已經(jīng)從以前的“靶動(dòng)物安全”轉(zhuǎn)變到“人類食品安全”和“環(huán)境安全”。鑒于此，當(dāng)前開展“消除水產(chǎn)品藥物殘留隱患的抗病技術(shù)研究”已顯得尤為重要，急需水產(chǎn)疫苗的開發(fā)應(yīng)用。

（二）水產(chǎn)疫苗的抗感染特性有廣泛的作用范圍

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，近20年來(lái)，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的疫病頻繁發(fā)生，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國(guó)每年水產(chǎn)養(yǎng)殖以疫病為主的病害發(fā)病率達(dá)50%以上，損失率20%左右，年經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)百億元之巨，并且還有上升的趨勢(shì)，顯然，疫病是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重大制約因素之一。疫苗的作用原理及大量的研究數(shù)據(jù)表明，水產(chǎn)疫苗適用于魚類、爬行類和兩棲類等脊椎動(dòng)物，并特異性地針對(duì)病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原的感染。 2004年中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示，我國(guó)水產(chǎn)病害各類養(yǎng)殖對(duì)象損失比例中，魚類占80%以上，各類型病害比例中病毒、細(xì)菌和寄生蟲分別占12.4%、41.4%和26.9%，共達(dá)80%以上，表明疫苗的作用范圍廣，在預(yù)防我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖傳染病將有良好的應(yīng)用前景。

（三）水產(chǎn)動(dòng)物免疫研究得到關(guān)注，產(chǎn)品研究?jī)?chǔ)備狀態(tài)良好

近年來(lái)，水產(chǎn)動(dòng)物免疫研究成為熱點(diǎn)，得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、973計(jì)劃、863計(jì)劃、攻關(guān)計(jì)劃以及省部等科技計(jì)劃的資助，加上分子技術(shù)的應(yīng)用，一些重要養(yǎng)殖對(duì)象的疫苗研究有了飛躍式的進(jìn)展。在水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)基礎(chǔ)方面，開展了海水魚、鱖魚等免疫球蛋白發(fā)生發(fā)育學(xué)、鱖粘膜抗體特性及其免疫應(yīng)答規(guī)律、施氏鱘體液免疫及調(diào)控機(jī)制、水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚免疫評(píng)價(jià)模型建立——免疫調(diào)節(jié)和免疫遺傳基因MHC研究等；在病原功能基因方面，獲取了大菱鲆虹彩病毒、鱖魚病毒和魚類神經(jīng)壞死病毒的主衣殼蛋白（MCP）基因、鯉春病毒血癥病毒囊膜蛋白基因、弧菌外膜蛋白基因和毒素基因等，并進(jìn)行了基因的克隆、高效表達(dá)與功能分析。部分疫苗已進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室魚體保護(hù)性試驗(yàn)和田間有效性試驗(yàn)階段（表5），并且疫苗的研究向浸泡甚至是口服等易于疫苗施予、低成本工廠化生產(chǎn)工藝的方向努力。可以預(yù)見，這些階段性成果的進(jìn)一步熟化，可在未來(lái)的3年～5年將有系列疫苗產(chǎn)品逐步實(shí)現(xiàn)商品化，將在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)病害防治中發(fā)揮重大作用。

表5 我國(guó)正在研究的水產(chǎn)疫苗產(chǎn)品

（四）嗜水氣單胞疫苗研究取得新進(jìn)展

嗜水氣單胞菌的致病范圍十分廣泛，可引起水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的赤斑病、打印病、腐皮病，對(duì)蝦敗血癥，蛙類的紅腿病，鱉類的穿孔病等。嗜水氣單胞菌可產(chǎn)生許多致病因子，目前已確證的毒力因子有氣溶素、溶血素細(xì)胞毒性腸毒素、胞外蛋白酶、載鐵體、s層蛋白及IV型菌毛等，其中胞外酶是重要的致病因子之一。

1.免疫機(jī)制

從非特異性細(xì)胞免疫角度看，嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌啟動(dòng)了巨噬細(xì)胞的吞噬活動(dòng)，它們的表面蛋白層保護(hù)菌體免于吞噬細(xì)胞破壞，從而為細(xì)菌在體內(nèi)擴(kuò)散、進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)繁殖和形成病灶提供了條件。關(guān)于嗜水氣單胞菌體液免疫機(jī)制的研究尚不全面，一些學(xué)者的研究表明，不同種類的水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗力有所差別，在對(duì)青、草、鰱、鳙四大家魚的抵抗力研究中得出嗜水氣單胞菌對(duì)4種魚的半致死濃度存在著顯著差異。此外，同一種動(dòng)物的不同養(yǎng)殖品種對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗力也存在著差異。

2.疫苗種類

嗜水氣單胞菌疫苗于1993年冬季開始在浙江、江蘇、湖北、河北等省廣泛使用。試驗(yàn)對(duì)象包括鯽、鰱、鳙等種類，到目前為止，已累積試驗(yàn)和推廣應(yīng)用疫苗5萬(wàn)畝以上。疫苗的應(yīng)用有效地預(yù)防了嗜水氣單胞菌敗血癥的發(fā)生和流行，因此而減少的經(jīng)濟(jì)損失每年可達(dá)上千萬(wàn)元。

全菌滅活疫苗：滅活疫苗是指利用某種方式滅活烈性野生病原的感染性，但保留其免疫原性而制備的疫苗。制備方法是通過(guò)細(xì)胞或生物接種，大量擴(kuò)增和收集病原體，然后以物理或化學(xué)方法，在確保免疫活力的情況下，將病原滅活。

研究表明，嗜水氣單胞菌熱滅活苗直接浸浴免疫能夠引起魚類局部的粘膜免疫應(yīng)答。陳月英等（1996）用福爾馬林滅活的嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株的全菌苗、胞外產(chǎn)物苗和菌體破碎苗分別免疫鯽魚后的結(jié)果可見，全菌苗注射免疫保護(hù)率為100%，破碎菌體苗的保護(hù)率為80%，以全菌苗最佳。相比之下，減毒活疫苗由于其具有恢復(fù)性致病的缺點(diǎn)而幾乎不被應(yīng)用于生產(chǎn)中。丁詩(shī)華等（2007）用聚乳酸-乙醇酸共聚物包裹嗜水氣單胞菌全菌后通過(guò)口服法誘導(dǎo)草魚的免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)魚體可以產(chǎn)生血清型抗體應(yīng)答和粘膜抗體應(yīng)答2種免疫應(yīng)答機(jī)制。

亞單位疫苗：亞單位疫苗即通過(guò)提取病原的某些成分制備成的疫苗。如病毒的衣殼蛋白、包膜糖蛋白，細(xì)菌的外膜蛋白、脂多糖（LPS）、外毒素、胞外蛋白酶等。亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)是除去了病原核酸，避免抗原間的競(jìng)爭(zhēng)，提高了免疫效果。因此具有接種劑量小、免疫原性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。董傳甫等（2005）制備了嗜水氣單胞菌主要外膜蛋白免疫刺激復(fù)合物亞單位疫苗，腹腔注射免疫歐洲鰻鱺，結(jié)果表明，用10倍半致死劑量攻擊的免疫保護(hù)率在80%以上，且沒(méi)有明顯的血清型特異性。

基因工程疫苗：基因工程疫苗包括基因工程亞單位疫苗、活載體疫苗核酸疫苗和多肽疫苗等，是隨著分子生物學(xué)技術(shù)，特別是DNA重組技術(shù)的發(fā)展而出現(xiàn)的一類新型疫苗。在魚類基因工程疫苗上，陳懷青等（1997）進(jìn)行了嗜水氣單胞菌HBC毒素基因的克隆及酶譜分析，為基因工程疫苗的研制提出了目的基因片段。謝俊鋒等（2002）用嗜水氣單胞菌外膜蛋白o(hù)mpTS基因在大腸桿菌中獲得表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定，且表達(dá)量高達(dá)51%，具有原外膜蛋白的免疫原性。

3.發(fā)展前景

目前，我國(guó)在全菌疫苗、減毒疫苗和菌體成分亞單位疫苗的制備上已經(jīng)取得了一些科研成果，但因嗜水氣單胞菌血清型眾多，不同地區(qū)、不同魚種類分離的菌株差異明顯，滅活疫苗使用劑量大，機(jī)體的免疫應(yīng)答水平低，弱毒苗存在毒力反應(yīng)強(qiáng)等原因而導(dǎo)致免疫效果不佳。近幾年針對(duì)嗜水氣單胞菌的保護(hù)性抗原基因構(gòu)成的基因工程疫苗以及更新一代的核酸疫苗，都具有較好地免疫效果，但仍處于試驗(yàn)階段，尚無(wú)商品化的疫苗投放市場(chǎng)。因此，開發(fā)新型疫苗以針對(duì)多種血清型菌株仍是今后防治嗜水氣單胞菌性疾病的重要方向。