90株鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因及ISAba1對OXA-23基因表達(dá)的影響

李 美,楊正海,李 婕,李小寧

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗(yàn)科,安徽蕪湖 241001)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Ab)屬于一種條件致病菌，有著較強(qiáng)的耐藥性，大多數(shù)感染Ab的患者僅僅對碳青霉烯類及多黏菌素類藥物治療有效[1]。根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，目前該菌株的臨床檢出率已經(jīng)超過銅綠假單胞菌，位于非發(fā)酵菌的首位，并且隨著多重耐藥菌株的出現(xiàn)，Ab的耐藥能力與耐藥廣泛性大幅度提高，因此如何控制Ab的傳播及如何快速有效地診治感染耐多藥Ab的患者，已經(jīng)變成臨床醫(yī)學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究人員遇到的棘手問題[2]。按照2015年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，不動(dòng)桿菌屬(Ab占93.4%)對亞胺培南與美羅培南的耐藥已經(jīng)達(dá)到62.0%與70.5%[3]。所以，分析其耐藥原因及消除和防控該菌的感染是十分關(guān)鍵的[4]。本研究對本院Ab OXA基因，以及ISAba1對OXA-23基因表達(dá)的影響進(jìn)行分析，分析Ab對碳青霉烯類抗菌藥物有著較高耐藥率的因素，通過迅速檢測Ab的ISAba1與OXA基因型，為早期診斷耐藥性的Ab、及時(shí)配合臨床科學(xué)化用藥治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料來源 收集本院2015年5月至2016年5月臨床分離的非重復(fù)Ab共90株。其中男性標(biāo)本65株，女性標(biāo)本25株，平均年齡均為64歲。其中痰78株，分泌物4株，血、尿和膿液各2株，引流液及腦脊液各1株。常規(guī)分離培養(yǎng)菌株，VITEK 2 Compact型全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定為Ab后保存于-80 ℃。質(zhì)控菌株AbATCC15151購自美國菌種中心，銅綠假單胞菌ATCC27853購自原國家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心。pET-28b(+)克隆載體，大腸埃希菌DH5α由安徽師范大學(xué)生命科學(xué)院朱國萍教授贈(zèng)送。

1.2儀器與試劑 VITEK 2 Compact型全自動(dòng)微生物鑒定儀及菌種鑒定和藥敏卡(法國梅里埃公司)、比濁儀(Bio-Merieux公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；生物安全柜(ESCO公司)；電泳儀、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；超純水儀、超低溫冰箱(美國NBS公司)等。2×Prime STAR MAX，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，DNA Marker Ⅱ，DNA Marker Ⅲ,溴乙錠，MH瓊脂，瓊脂糖均購自北京天根生物科技公司；PCR引物合成，測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。本實(shí)驗(yàn)中所用引物，見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物

注：*為PCR擴(kuò)增blaOXA-23和ISAba1全序列所用引物；-為無數(shù)據(jù)

1.3方法

1.3.1模板DNA的制備 根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)說明書按照操作步驟提取DNA模板，PCR電泳檢測確認(rèn)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2耐藥基因的檢測 多重PCR檢測(10 μL體系)：多重PCR檢測OXA基因及插入序列1(blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58和ISAba1)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸20 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)含0.5 μg/mL溴乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察結(jié)果并拍照。

PCR擴(kuò)增耐藥基因全序列(50 μL體系)：blaOXA-23和ISAba1基因完整序列的擴(kuò)增。其PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、55 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。ISAba1-blaOXA-23基因完整序列的擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、60 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。

1.3.3瓊脂糖凝膠電泳 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)含0.5 μg/mL溴乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察結(jié)果并拍照。

1.3.4PCR產(chǎn)物的純化 天根生化公司DNA產(chǎn)物純化試劑盒，按說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

1.3.5PCR產(chǎn)物的連接 雙酶切的PCR產(chǎn)物blaOXA-23和ISAba1和ISAba1-blaOXA-23與雙酶切的pET-28(+)質(zhì)粒的連接。

1.3.6PCR連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與測序 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。對PCR陽性的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)后送南京金斯瑞生物科技有限公司采用3730 DNA自動(dòng)測序儀(Applied Biosystems公司)雙向測序。測序結(jié)果經(jīng)BioEdit軟件拼接后在GenBank數(shù)據(jù)庫在線Blast，分析blaOXA-23序列的一致性，并用BioEdit軟件制作比對圖。

1.3.7藥敏實(shí)驗(yàn) 采用肉湯稀釋法測定轉(zhuǎn)化陽性菌株和空載質(zhì)粒重組菌株對亞胺培南和美羅培南的最低抑菌濃度(MIC)值，操作及結(jié)果解釋參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)2015年標(biāo)準(zhǔn)判斷。

2 結(jié) 果

2.1OXA酶基因和插入序列ISAba1檢測結(jié)果 90株Ab中，耐碳青霉烯類藥物的菌株有61株，所有菌株blaOXA-51均是陽性， 其中blaOXA-23陽性菌株73株，ISAba-1陽性菌株86株，未檢測到blaOXA-24，blaOXA-58陽性菌株，17株未檢測到blaOXA-23陽性的菌株中有11株對亞胺培南敏感，11株對亞胺培南敏感的菌株中有4株也未檢測到ISAba1，見表2。部分多重PCR電泳結(jié)果，見圖1。

表2 90株Ab blaOXA酶基因及ISAba1的檢出率

2.2轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 挑選blaOXA-23和ISABa1陽性菌株進(jìn)行全序列PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的blaOXA-23，ISABa1，ISABa1-blaOXA-23全序列轉(zhuǎn)化DH5α，重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果顯示blaOXA-23，ISABa1，ISABa1-blaOXA-23和PET-28b(+)載體均連接成功，PCR電泳結(jié)果，見圖2。提取經(jīng)雙酶切鑒定正確的陽性克隆菌株1ml交送南京金斯瑞有限公司采用雙向測序，測序引物為pET-28b(+)通用引物。用BioEdit軟件與GenBank中已報(bào)道的基因序列進(jìn)行比對，都與注冊號(hào)為GQ861439.1的Ab菌株100%一致。

注：M為標(biāo)記物；1～2,4～8,10～11泳道為含有blaOXA-23，blaOXA-51和ISAba1的菌株檢測結(jié)果；3泳道為含有blaOXA-51和ISAba1的菌株檢測結(jié)果；9泳道為僅含有blaOXA-51的菌株檢測結(jié)果

圖1多重PCR檢測4種OXA酶基因及插入序列1的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶

注：M為標(biāo)記物；1泳道為空載pET-28b(+)質(zhì)粒；2泳道為含有blaOXA-23的重組質(zhì)粒的檢測結(jié)果；3泳道為含有ISAba1的重組質(zhì)粒檢測結(jié)果；4泳道為含有ISABa1-blaOXA-23的重組質(zhì)粒檢測結(jié)果

圖2重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3轉(zhuǎn)化菌株藥敏實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)化陽性菌株pET28b(+)-blaOXA-23、pET28b(+)-ISAba1、pET28b(+)-ISAba1-blaOXA-23和空載的pET28b(+)對亞胺培南MIC值分別為4.00、1.00、64.00、和0.12 μg/mL。對美羅培南MIC值分別為4.00、0.50、16.00和0.03 μg/mL。

3 討 論

現(xiàn)如今醫(yī)療水平不斷在迅猛發(fā)展，但是全球范圍內(nèi)都有著同樣一個(gè)趨勢，即Ab的臨床感染和耐藥現(xiàn)狀日益嚴(yán)重，尤其是對耐碳青霉烯類的Ab治療方法十分有限，應(yīng)當(dāng)引起醫(yī)務(wù)人員的高度重視[6]。因此研究Ab流行菌株的耐藥基因特征對于指導(dǎo)合適的抗菌藥物針對性的治療就顯得極其重要[7]。

眾所周知，D類blaOXA是Ab最常見的碳青霉烯酶。除了固有的blaOXA-51酶，還包括blaOXA-23，blaOXA-24，blaOXA-58類型的碳青霉烯水解酶[8]。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測90株Ab的OXA酶基因和ISAba1，其中耐碳青霉烯類藥物的菌株有61株，發(fā)現(xiàn)所有的菌株均攜帶blaOXA-51，blaOXA-23陽性菌株73株，ISAba1陽性菌株86株，blaOXA-23和ISAba1均為陽性的菌株73株，未檢測到blaOXA-24，blaOXA-58陽性菌株，17株未檢測到blaOXA-23陽性的菌株中有11株對亞胺培南敏感，11株對亞胺培南敏感的菌株中有4株也未檢測到ISAba1，說明本地區(qū)的OXA酶基因型主要以blaOXA-23和blaOXA-51為主，Ab對碳青霉烯類抗菌藥物存在較高的耐藥性與blaOXA-23基因的表達(dá)存在關(guān)系，插入ISAba1也在耐碳青霉烯的Ab中發(fā)揮著一定的作用。61株耐碳青霉烯的Ab中有55株blaOXA-23陽性(占90.16%)，與WU等[9]的研究結(jié)果相符，即在中國blaOXA-23是Ab中最常見的碳青霉烯酶基因，并且90%的亞胺培南耐藥菌株存在blaOXA-23。

Ab的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，其耐藥的生化機(jī)制主要涉及產(chǎn)氨基糖甙類藥物修飾酶、AmpC酶、碳青霉烯酶、青霉素結(jié)合蛋白的改變和主動(dòng)外排泵出機(jī)制、代謝方式的改變、外膜蛋白的丟失或膜孔蛋白的缺損等[10]。為了更好地了解blaOXA-23，與ISAba1以及ISAba1-blaOXA-23對碳青霉烯類抗菌藥物產(chǎn)生的影響,為了防止其他條件對其造成影響，本實(shí)驗(yàn)選取了blaOXA-23基因和ISAba1陽性菌株設(shè)計(jì)了全序列耐藥基因PCR擴(kuò)增。分別將blaOXA-23基因，ISAba1和帶有插入序列ISAba1的blaOXA-23全序列片段轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中，測序，其中ISAba1位于blaOXA-23基因上游33 bp處。通過MH肉湯稀釋法測得轉(zhuǎn)化陽性菌株pET28b(+)-blaOXA-23、pET28b(+)-ISAba1、pET28b(+)-ISAba1-blaOXA-23和空載的pET28b(+)對亞胺培南MIC值分別為4.00、1.00、64.00、和0.12 μg/mL。對美羅培南MIC值分別為4.00、0.50、16.00和0.03 μg/mL。檢測結(jié)論說明，單獨(dú)的blaOXA-23和ISAba1能夠?qū)μ记嗝瓜╊惪咕幬锏哪退幮援a(chǎn)生影響，不過ISAba1對blaOXA-23基因的高表達(dá)，導(dǎo)致Ab對碳青霉烯類抗菌藥物呈現(xiàn)高度耐藥。研究結(jié)果和VIANA等[11]的文章報(bào)道是一致的。

綜上所述，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)快速檢測AbblaOXA-23基因和ISAba1，可以及時(shí)篩選blaOXA-23基因和ISAba1陽性的Ab，從而避免使用碳青霉烯類藥物，為臨床科學(xué)用藥，有效減少高耐藥、多重耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生提高理論依據(jù)。