糖尿病腎病患者尿液miR-192的表達(dá)及臨床意義

陳月英，羅曉星，謝詠梅，李金一，劉 敏

(中國人民解放軍第四五八醫(yī)院：1.內(nèi)分泌科；2.干部病房，廣州 510062)

糖尿病腎病(DN)是2型糖尿病(T2DM)嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。隨著近年來全球范圍T2DM的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，DN已成為導(dǎo)致終末期腎臟病(ESRD)的首要病因[1]。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明；且目前針對(duì)DN的早期檢測(cè)手段還存在不足。因此，能夠早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)測(cè)DN，對(duì)于及時(shí)治療或延緩DN的進(jìn)展，改善DN患者預(yù)后具有非常重要的意義。已有的研究證實(shí)，尿液中蘊(yùn)藏豐富的與腎臟疾病相關(guān)的生物學(xué)信息，因此長期以來尿液檢測(cè)為臨床腎臟疾病診斷和療效監(jiān)控的重要手段[2]。微小RNA(miRNA) 是一類內(nèi)源性的、非編碼的單鏈小分子RNA。研究證實(shí)，miRNA在血清、尿液、唾液，以及其他體液中穩(wěn)定表達(dá)。通過調(diào)控多個(gè)上游基因表達(dá)和下游蛋白翻譯，在人體多種生理病理過程起著非常重要的作用[3]。有研究表明，miR-192能調(diào)控系膜細(xì)胞的增殖、凋亡，促進(jìn)腎纖維化，與DN的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4]。本研究旨在通過檢測(cè)T2DM患者尿液miR-192水平，研究其與T2DM患者發(fā)生DN的相關(guān)性，探討尿液miR-192對(duì)DN早期診斷和療效判斷的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年6月至2016年12月在本院內(nèi)分泌科接受治療的140例T2DM患者作為研究對(duì)象，年齡57～67歲，平均(52.7±6.4)歲；其中男86例，女54例。所有納入研究患者均符合1999年WHO制訂的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿病、各種急慢性感染性疾病、惡性腫瘤、心腦血管意外，DM以外其他腎臟疾病。根據(jù)DM防治專家共識(shí)(2014年版)[5]，按照24 h尿清蛋白定量(24 h-UAE)將140例T2DM患者分為3組：正常蛋白尿組(24 h-UAE<30 mg) 55例，微量蛋白尿組(24 h-UAE<300 mg) 48例，大量蛋白尿組(24 h-UAE≥300 mg) 37例。另選擇30例健康體檢者作為對(duì)照組。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 Trizol Reagent 購自Invitrogen公司；miRNA SYBR Green PCR Kit、miScript Reverse Transcription Kit、miR-192引物和U6引物序購于購自天根生化科技(北京)有限公司；Nanodrop?ND-1000微量紫外分光光度計(jì)購自美國NanoDrop公司；Prism?7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；-80 ℃低溫冰箱購自日本三洋公司。

1.3方法

1.3.1尿液標(biāo)本收集 每個(gè)研究對(duì)象收集新鮮晨尿20 mL，4 ℃環(huán)境下，于離心機(jī)上2 000 r/min離心20 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) (1)總RNA提?。翰捎肨rizol試劑對(duì)尿液總RNA進(jìn)行提取。每份尿液標(biāo)本加入1.5 mL 的Trizol進(jìn)行裂解。經(jīng)過RNA分相、沉淀、洗滌、溶解后。使用Nanodrop測(cè)定RNA 在分光光度計(jì)260、280和230 nm的吸收值，對(duì)提取的RNA濃度和純度進(jìn)行評(píng)估。用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA 純度及完整性。(2) 逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)：按照miScript Reverse Transcription Kit[天根生化科技(北京)有限公司]操作步驟構(gòu)建10 μL反應(yīng)體系：RNA 3 μL，1×mirVana RT Primer 1 μL，Array script Enzyme Mix 0.4 μL，mirVana RT Buffer(5×) 2 μL，加RNase-free water至總體積10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)60 min； 85 ℃滅活5 min。(3)RT-PCR反應(yīng)：按照miRNA SYBR Green PCR Kit[天根生化科技(北京)有限公司]操作步驟進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系：5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL，PCR Forward Primer(20×) 1 μL，PCR Reverse Primer(20×) 1 μL，1×cDNA模板1～2.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加入ddH2O至總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min； 循環(huán)條件(95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，10 s) 40個(gè)PCR循環(huán)。以U6 snRNA作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT想對(duì)定量法法進(jìn)行分析。

1.3.3生化指標(biāo)檢測(cè) C肽、24 h-UAE檢測(cè)采用放射免疫分析法(RIA法)，血糖、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、胱抑素C用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。腎小球?yàn)V過率(eGFR) =186×[SCr(mg/dL)]-1.54×[年齡(歲)]-0.203×(0.742×女性)。

2 結(jié) 果

2.1各組間臨床資料比較 對(duì)照組和T2DM 3組間年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；正常蛋白尿組、微量蛋白尿組、大量蛋白尿組3組間糖尿病病程、SCr、胱抑素C、eGFR比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而空腹血糖、糖化血紅蛋白在T2DM 3組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；大量蛋白尿組24 h-UAE、BUN要高于微量蛋白尿組(P<0.05)，而在正常蛋白尿組和微量蛋白尿組之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組尿液miR-192的表達(dá)水平比較 通過RT-PCR檢測(cè)各組患者尿液中miR-192表達(dá)的CT值。以U6為內(nèi)參基因，經(jīng)2-ΔΔCT法計(jì)算，結(jié)果顯示：正常蛋白尿組、微量蛋白尿組、大量蛋白尿組患者尿液miR-192表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常蛋白尿組、微量蛋白尿組、大量蛋白尿組間尿液miR-192表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表2。

2.3尿液miR-192水平與DN臨床指標(biāo)間的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DN患者尿液miR-192水平與SCr、BUN、24 h尿蛋白和胱抑素C呈正相關(guān)(P<0.05)。而與糖尿病病程、空腹血糖和糖化血紅蛋白無相關(guān)性(P>0.05)，見表3。

表1 各組臨床資料比較

注：與微量蛋白尿組相比，*P<0.05；與正常蛋白尿組相比，▲P<0.05；-表示無數(shù)據(jù)

注：A為尿液總RNA；B為溶解曲線；C為擴(kuò)增曲線

圖1 miR-192PCR反應(yīng)圖表2 各組尿液miR-192表達(dá)相對(duì)值比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05；與正常蛋白尿組比較,▲P<0.05；與微量蛋白尿組比較,#P<0.05

表3 尿液miR-192水平與DN患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

2.4尿液miR-192水平對(duì)DN的預(yù)測(cè)價(jià)值 以24 h-UAE和eGFR反應(yīng)腎損傷標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)值為因變量，尿液miR-192水平值作為自變量進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果顯示尿液miR-192水平與DN有相關(guān)性，是T2DM患者發(fā)生DN的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P<0.05)，見表4。

表4 尿液miR-192與24 h-UAE和eGFR的回歸分析

3 討 論

在人體細(xì)胞中，miRNA能通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的形式與靶基因的3′ UTR部分或完全互補(bǔ)，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者直接抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，最終在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA的發(fā)現(xiàn)揭示了一種新的基因表達(dá)調(diào)控方式，即不同miRNA和靶基因之間能夠形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮精細(xì)凋控功能基因表達(dá)的作用[6]。目前針對(duì)miRNA的生物功能學(xué)研究證實(shí)，miRNA參與包括細(xì)胞發(fā)育、生長、增殖、分化、凋亡、免疫、腫瘤發(fā)生等一系列生理病理過程，并且在腎臟生理功能調(diào)控和腎臟相關(guān)疾病如DM發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用[7]。由于miRN具有生物遺傳和種屬表達(dá)保守性的特點(diǎn)，在生物發(fā)育的不同階段和不同組織中均表達(dá)不同種類miRNA分子。尤為值得關(guān)注的是，在各種疾病病變細(xì)胞、組織，以及患者本身各種體液中均能夠發(fā)現(xiàn)與所患疾病相關(guān)的miRNAs異常表達(dá)[8]。目前研究顯示在腎臟疾病患者尿液中均存在穩(wěn)定和特定表達(dá)的miRNA，對(duì)腎病的診斷和預(yù)后評(píng)估均顯示出潛在的臨床價(jià)值，有望成為腎病理想的無創(chuàng)檢測(cè)生物標(biāo)志物[9]。

miR-192是在腎臟組織中，尤其在系膜細(xì)胞中特異性表達(dá)的miRNA。有研究表明miR-192與缺血再灌注腎損傷、腎臟纖維化與DN過程密切相關(guān)。KATO等[10]發(fā)現(xiàn)miR-192在DN大鼠腎小球內(nèi)呈過量表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-192通過下調(diào)E-box阻抑蛋白來控制腫瘤壞死因子(TGF)-β1 誘導(dǎo)的ColIα2 表達(dá)，進(jìn)而參與DN的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白蓄積進(jìn)程。PUTTA等[11]研究發(fā)現(xiàn)，通過LNA-anti-miR-192抑制DN小鼠miR-192的表達(dá)能促進(jìn)Zeb1/2表達(dá)，抑制膠原、TGF-β、纖維連接蛋白的表達(dá)。而且LNA-anti-miR-192能夠明顯降低糖尿病小鼠蛋白尿水平。CHIEN等[12]研究發(fā)現(xiàn)，伴有明顯蛋白尿的DN患者血清miR-192要高于正常蛋白尿DN患者。且這種高表達(dá)與DN疾病的進(jìn)程有關(guān)。本研究采用RT-PCR檢測(cè)不同病程DN患者尿液miR-192的表達(dá)水平。結(jié)果顯示DN患者尿液miR-192表達(dá)顯著高于健康人。且隨著DN患者尿液中蛋白水平的增加，其尿液miR-192表達(dá)也明顯增加(即大量蛋白尿組>微量蛋白尿組>正常蛋白尿組)。以上研究同國內(nèi)外多個(gè)相關(guān)研究結(jié)論是一致的，即DN患者尿液miR-192表達(dá)在一定程度上反映DN的病理進(jìn)展。然而，也有與上述研究相反的結(jié)論。如KRUPA等[4]報(bào)道在DN患者腎小管上皮細(xì)胞中miR-192表達(dá)明顯下降，且這種低表達(dá)與低腎小球?yàn)V過率和腎小管間質(zhì)纖維化相關(guān)。造成DN相關(guān)miR-192研究結(jié)果不一致的原因目前尚不清楚，尚待進(jìn)一步研究論證。本實(shí)驗(yàn)中相關(guān)分析結(jié)果顯示DN患者尿液miR-192水平與SCr、BUN、24 h尿蛋白和胱抑素C呈正相關(guān)。而SCr、BUN、24 h尿蛋白和胱抑素C均是目前公認(rèn)的反映腎小球?yàn)V過率變化的指標(biāo)。此外，本研究應(yīng)用線性回歸分析建立了基于DN臨床指標(biāo)間的綜合診斷預(yù)測(cè)模型，結(jié)果進(jìn)一步提示尿液miR-192水平與DN具有相關(guān)性，是T2DM患者發(fā)生DN的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。即T2DM患者尿液miR-192水平值越高，發(fā)生DN的可能性也越大。

目前臨床上常用的反映DN患者腎功能損傷的指標(biāo)尚存在不足。如SCr、內(nèi)生肌酐清除率、BUN和24 h尿蛋白對(duì)于診斷DN，尤其是早期DN的特異性有局限性，且受較多腎外因素影響[13]。而miR-192以往和本研究中表現(xiàn)出現(xiàn)的腎臟組織特異性，與目前常用的DN尿液生物學(xué)標(biāo)記物存在密切的相關(guān)性，以及DN的獨(dú)立預(yù)測(cè)能力。表明尿液miR-192有潛力成為DN的早期檢測(cè)診斷標(biāo)志物，有望為DN提供更敏感和可靠的指標(biāo)。尤為值得關(guān)注的是，有研究通過特異性抑制腎臟細(xì)胞中miR-192的表達(dá)能夠緩解腎臟纖維化，改善蛋白尿水平。這也為未來靶向治療DN提供了新的思路和手段。